Produção de sonda de DNA diretamente biotinilada com N-hidroxisuccinimida biotina ester (BNHS).

A utilização de sondas de DNApara análise genômica em fase sólida tem seexpandido e ultrapassado as áreas da pesquisa, estendendo-seao terreno do diagnóstico de rotina nas áreas demedicina humana e animal, bem como nas ciências forenses.Estas sondas têm sido utilizadas desde o surgimento da primeiratécnica de hibridização descrita com o southernblotting, que envolve a imobilização, em filtrosde papel, de fragmentos de DNA separados eletroforeticamente.Outra técnica descrita como o dot-hibridizaçãoé menos complexa do que o southern convencional por nãorequerer o passo prévio de eletroforese e por ser menosexigente quanto à qualidade do DNA, já que dispensaa digestão com enzima de restrição. A marcaçãomais comum para estas sondas é o fósforo radioisótopo(32P), que, apesar de sua alta sensibilidade, apresenta os inconvenientesde risco físico, necessidade de autorizaçãopara manipulação de radioisótopos, alto custoe uma vida média muito curta. Uma série de alternativaspara o 32P têm sido utilizadas, com marcas diretas ou secundárias,entre elas a biotina, que tem mostrado grandes vantagens e temsido usada também em laboratórios especializadose bem equipados. Este trabalho descreve uma modificaçãodo método clássico descrito para sondas de DNA acopladaspor biotina hidrazida. Utilizamos a N-hidroxisuccinimida biotina(BNHS) em dimetilformamida, para marcar resíduos de citosinadisponíveis em segmentos de fita simples de DNA extraídode Corynebacterium pseudotuberculosis. A variaçãoda proporção de biotina e de DNA, bem como sua especificidadee sensibilidade, foram cuidadosamente testadas e criteriosamenteanalisadas através de ensaios de hibridização,adsorvendo-se DNA cromossômico do C. pseudotuberculosise outros DNAs em papel de nitrocelulose, seguindo-se a incubaçãocom as sondas biotiniladas descritas,avidina-peroxidase e revelaçãocom 4-cloro-1-naftol. Os resultados mostraram que a sonda de DNAproduzida tem as características favoráveis esperadas.Desde que não é necessário o nick translationnem a utilização de material radioativo ou mesmode hidrazida, sondas deste tipo podem ser utilizadas no auxíliodo diagnóstico de infecções por C. pseudotuberculosise outros microorganismos.