Effect of poly (ADP-ribose) polymerase-1 inhibition on concentrations of intracellular calcium and ATP and survival of cultured rat cerebellar neurons in overstimulation of glutamate receptors

Актуальность. Изучение механизмов действия ингибиторов ядерного фермента поли (АТФ-рибозо) полимеразы-1 (PARP-1) на динамику изменения внутриклеточной концентрации Ca2+ ([Ca2+]i), содержание АТФ в нейронах и их выживаемость при избыточной стимуляции глутаматных рецепторов способствует пониманию биохимических процессов при инсультах мозга и подбору препаратов для терапии последствий. Цель. Определить изменения [Ca2+]i, концентрации ATФ ([ATФ]) и выживаемости клеток при одновременном действии токсических концентраций глутамата (Glu) и ингибиторов PARP-1, и выяснить возможность участия нейрональной NO-синтазы (nNOS) в активации PARP-1. Методы и материалы. Исследование выполнено с использованием 7-8 дневных первичных культур нейронов мозжечка крысы. Изменения [Ca2+]i определяли методом флуоресцентной микроскопии с помощью Fura-FF. Cодержание [АТФ] измеряли с использованием люциферин-люциферазной биолюминесценции. Выживаемость нейронов оценивали с помощью МТТ-теста по восстановлению соли тетразолия до формазана. Активность PARP-1 и nNOS контролировали с помощью ингибиторов. Результаты. Показано, что ингибиторы PARP-1 миноциклин (0,2 мкМ) и бензамид 1 мМ) отдаляют наступление индуцированной глутаматом отсроченной кальциевой дизрегуляции, уменьшают понижение внутриклеточной [АТФ] и увеличивают выживаемость культивируемых нейронов. Ингибитор nNOS 7-нитроиндазол (100мкМ) оказывал на [ATФ] и выживаемость нейронов эффекты, аналогичные ингибиторам PARP-1. Выводы. Положительныое действие ингибиторов PARP-1 и nNOS на выживаемость клеток, подвергнутых токсическому действию Glu, обусловлено, вероятно, тем, что ингибиторы поддерживают более высокую [ATФ] во время и после прекращения воздействия Glu, позволяя большей доле нейронов в культуре восстановить ионный гомеостаз. Background. Studying mechanisms of the nuclear enzyme, poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), inhibition on changes in intracellular Ca2+ ([Ca2+]i and ATP [ATP] concentrations in neurons provides understanding of biochemical processes in stroke and helps selection of drugs for the treatment of consequences of glutamate hyperexcitability. Aim. To determine changes in [Ca2+]i, [ATP], and cell survival under a simultaneous action of toxic concentrations of glutamate (Glu) and PARP-1 inhibitors, and to elucidate a possibility of neuronal NO synthase (nNOS) contribution to the PARP-1 activation. Methods and materials. Changes in [Ca2+]i were studied using fluorescence microscopy. The [ATP] was measured using luciferin-luciferase bioluminescence. Survival of neurons was assessed using the MTT assay based on reduction of a tetrazolium salt into formazan. Results. The PARP-1 inhibitors, minocycline (0.2 μM) and benzamide (1 mM), delayed the onset of the secondary rise of [Ca2+]i (delayed calcium dysregulation), limited the Glu-induced decrease in intracellular [ATP], and improved survival of cultured neurons. The nNOS inhibitor, 7-nitroindazole (100 μM), exerted effect on [ATP] and neuron survival similar to those of PARP-1 inhibitors. Conclusion. The positive effects of PARP-1 nNOS inhibitors on cell survival were presumably due to the fact that the inhibitors maintained a higher [ATP] during and after the end of the toxic Glu action, which allowed a greater proportion of cultured neurons to restore the ion homeostasis.