Metodología para la determinación de cortisol plasmático en peces usando la prueba de inmunoensayo enzimático (ELISA)

Objetivo. Describir el procedimiento para determinar cortisol plasmático en peces, utilizando la prueba de inmunoensayo enzimático (ELISA). Materiales y métodos. Dos muestras de plasma de trucha arco iris Oncorhynchus mykiss fueron analizadas empleando un kit de ELISA desarrollado para humanos. Siete soluciones estándar conteniendo 0, 20, 50, 100, 200, 400 y 800 ng.ml-1 de cortisol fueron usadas para construir una curva de calibración. Para la prueba de recuperación se emplearon las soluciones estándar de 50, 100 y 200 ng.ml-1; finalmente, para la prueba de linealidad se prepararon cuatro diluciones de las muestras de plasma, así: 1/2, 1/4, 1/8 y 1/16. A cada pozo de la placa se adicionaron tanto las muestras de plasma como las soluciones estándar, las cuales fueron conjugadas con peroxidasa y posteriormente se adicionó el substrato de la enzima. Esta reacción enzimática se detuvo por medio de la adición de ácido fosfórico (0.5 M) y posteriormente, la absorbancia fue medida a 450 nm. La precisión del procedimiento de pipetaje fue evaluado previo a la prueba. El porcentaje de recuperación y de linealidad, así como la curva de calibración y de paralelismo fueron determinadas. Resultados. La curva estándar mostró un alto coeficiente de correlación (r2 = 0.998). La concentración de cortisol en las dos muestras de plasma fluctuó entre 64 y 72 ng.ml-1. Sólo la solución estándar de 200 ng.ml-1 mostró un porcentaje de recuperación superior al 80%; en contraste, en las soluciones estándar de 50 y 100 ng.ml-1 el porcentaje de recuperación fluctuó entre 52 y 71%. En las diluciones de 1/2 y 1/8 se observó un buen porcentaje de linealidad (86 a 168%). Finalmente, las muestras mostraron cierto grado de paralelismo con la curva estándar. Conclusiones. El uso de la prueba de ELISA para determinar cortisol plasmático en humanos, es confiable y eficiente para la cuantificación de cortisol plasmático en peces.