OPTIMASI DAN EVALUASI METODE KRIOPRESERVASI PURWOCENG

ABSTRAK Optimasi dan evaluasi metode kriopreservasi perlu dilakukan dalam menentukan protokol standar untuk penyimpanan jangka panjang biakan purwoceng. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh kombinasi perlakuan pratumbuh, prakultur, dan formulasi media pemulih terhadap daya tumbuh dan daya regenerasi tunas in vitro dan kalus embriogenik serta untuk mengevaluasi metode kriopreservasi melalui observasi morfologi, anatomi, dan sitologi. Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan BB Litbang Biogen pada tahun 2008-2009. Teknik kriopreservasi yang digunakan adalah vitrifikasi (untuk apeks) dan enkapsulasi-vitrifikasi (untuk kalus embriogenik). Pada teknik vitrifikasi, tunas pucuk diberi perlakuan pratumbuh dengan sukrosa (3, 4, 5, dan 6%) selama 1 dan 2 minggu, perlakuan prakultur dilakukan pada media yang mengandung sukrosa 0,3 M selama 1 dan 3 hari, perlakuan dehidrasi dengan PVS2 diberikan selama 15 dan 30 menit, dan media pemulih yang diujikan adalah media dasar MS atau DKW dengan dan tanpa penambahan adenin sulfat 20 ppm. Pada teknik enkapsulasi-vitrifikasi, kalus embriogenik dienkapsulasi terlebih dahulu dengan Na-alginat 3%, perlakuan dehidrasi dengan PVS2 diberikan selama 0, 30, dan 60 menit. Evaluasi metode teknik kriopreservasi dilakukan melalui pengamatan morfologi secara visual, anatomi meristem dengan scanning electron microscope (SEM), pengujian viabilitas dengan fluorescein diacetate (FDA), dan analisis ploidi secara flowcytometry. Hasil penelitian menunjukkan bahwa teknik enkapsulasi-vitrifikasi lebih baik daripada teknik vitrifikasi untuk kriopreservasi purwoceng. Walaupun persentase keberhasilan kriopreservasi rendah (10%), kalus embriogenik purwoceng mampu berproliferasi dan beregenerasi menjadi ribuan embrio somatik dewasa. Evaluasi metode kriopreservasi dengan SEM dan FDA dapat diterapkan untuk memperkirakan keberhasilan teknik kriopreservasi secara dini sedangkan analisis flowcytometry dapat diterapkan untuk menguji stabilitas genetik bahan tanaman pasca-kriopreservasi. Kata kunci: Pimpinella pruatjan Molk., kriopreservasi, SEM, FDA, flowcytometry ABSTRACT Optimization and evaluation of cryopreservation methods should be conducted to obtain standard protocol for long term conservation of pruatjan. The objective of this study was to evaluate the effect of combined treatments of pregrowth, preculture, and recovery media to the survival and regeneration rate of in vitro shoots and embryogenic calli and to evaluate the cryopreservation methods by observing the morphological, anatomical, and cytological characters. The techniques of vitrification (for apex) and encapsulation-vitrification (for embryogenic calli) were applied in this study. On vitrification technique, the apical shoots were pregrown on media containing of 3, 4, 5, and 6% sucrose for 1 and 2 weeks, precultured on media containing of 0,3 M sucrose for 1 and 3 days, dehydrated by PVS2 solution for 15 and 30 minutes, and planted on recovery media (MS or DKW basal media supplemented with 20 ppm adenine sulphate). On encapsulation-vitrification technique, embryogenic calli were encapsulated by 3% Na-alginate, dehydrated by PVS2 solution for 0, 30, and 60 minutes. The evaluation of cryopreservation methods was done through visual observation, SEM analysis, viability test, and flowcytometry determination. The result showed that encapsulation- vitrification was better than vitrification technique for cryopreservation of pruatjan. The successful rate of this method was low (10%) but the embryogenic calli could proliferate and regenerate into thousands mature somatic embryos. The evaluation by SEM and FDA can be applied as early detection to estimate the successful of cryopreservation, whereas flowcytometry  analysis  may  determine  the  genetic  stability  of cryopreserved materials. Key words: Pimpinella pruatjan Molk., cryopreservation, SEM, FDA, flowcytometry