Выделение и идентификация генов сукцинатдегидрогеназы мембранными методами

Важнейшим этапом подготовки биологических образцов для проведения биохимических и/или диагностических процессов является выделение нуклеиновых кислот из образца. Выбор метода выделения РНК зависит прежде всего от поставленных задач, а также от ряда требований, основными из которых являются следующие: экономичность и простота метода, высокий выход выделяемой РНК, а также достаточная степень очистки конечного продукта. Целью данной работы являлась идентификация генов сукцинатдегидрогеназы в клетках печени крыс с использованием силикагельной мембраны для выделения суммарной клеточной РНК. Набор PureLink®RNA MiniKit (Invitrogen, США) позволил получить препарат суммарной РНК практически без следов деградации, что подтверждается содержанием 28S рРНК примерно в три раза превышающим содержание 18S рРНК. Технология PureLink® обеспечила высокий выход РНК. Важным преимуществом данного метода явилось также то, что он не требует экстрагирования токсичными растворителями (фенол/хлороформ), центрифугирования с CsCl или LiCl и осаждения спиртом, т.е. использования веществ, являющихся ингибиторами ПЦР. Кроме того, в связи с малой сменой наконечников и эппендорфов, возможность загрязнения значительно сокращена, что подтверждено спектрофотометрически (соотношение A260/A280 для выделенного препарата РНК составило 2,03, а A260/A230– 1,98, что характеризует его как высокоочищенный). Таким образом, была подобрана эффективная методика выделения суммарной клеточной РНК, не имеющая в своем составе примесей посторонних нуклеиновых кислот. Чистая РНК, полученная в ходе выделения с применением силикагельной мембраны, в дальнейшем применяли для получения комплементарной ДНК. Полученная кДНК, путём применения метода реакции обратной транскрипции, использовалась в дальнейшем для количественной оценки содержания транскриптов генов, кодирующих субъединицы А и В (sdha и sdhb) сукцинатдегидрогеназы. Проведенный в дальнейшем ПЦР-анализ показал, что подобранные нами праймеры являются специфичными и могут быть использованы в дальнейших исследованиях по определению скорости транскрипции генов sdha и sdhb сукцинатдегидрогеназы у крыс в норме и при различных патологиях.