Выделение изоформ НАД+-зависимой малатдегидрогеназы кукурузы хроматографическими методами

НАД+-малатдегидрогеназа (НАД+-МДГ, КФ 1.1.1.37) является распространенным ферментом, играющим важную роль во многих метоболических процессах, таких как ЦТК, азотный обмен и транспорт НАДН. Различные условия среды сильно влияют на активность ферментов, активируя или ингибируя ее. Целью данной работы было исследование изменения активности малатдегидрогеназ при действии различных температур. В качестве объекта исследования выступали 10-дневные проростки Zea mays, выращенные гидропонным методом. Изоферменты малатдегидрогеназ из листьев кукурузы были очищены с помощью четырехстадийной очистки, включавшей в себя стадии гомогенизирования растительного материала, осаждения белка сульфатом аммония в концентрации 25-80% насыщения, гель-фильтрации через сефадекс G-25 и ионообменной хроматографии на колонке, заполненной ДЭAЭ-Sephacel. Элюция проводилась линейным градиентом хлористого натрия в концентрации от 0 до 150 мМ, в процессе которой собирались фракции с малатдегидрогеназной активностью. Измерение активности ферментов проводилось спектрофотометрически по определению скорости образования или расходования НАДН при длине волны 340 нм. Электрофоретические исследования проводили в полиакриламидном геле с последующим универсальным окрашиванием белков нитратом серебра или специфическим проявлением ферментативной активности тетразолиевым методом с индукцией образования нерастворимого диформазана в месте расположения фермента. Препарат цитоплазматической МДГ характеризовался удельной активностью 256 Е/мг белка и степенью очистки 115. Выход составил 3.5 %. Удельная активность митохондриальной формы исследуемого фермента равнялась 155 Е/мг белка при степени очистки 67 и выходе 2%. Пероксисомальная форма МДГ характеризовалась удельной активностью 180 Е/мг белка, степенью очистки 78 и выходом 1%. Было показано незначительное влияние получасовой инкубации фермента при 7, 15, 30оС. Определены температурные оптимумы для прямой и обратной реакций трех форм малатдегидрогеназ: 25 и 45оС для цитоплазматической и 30 и 45оС для митохондриальной. Температурный оптимум пероксисомальной формы для реакций окисления малата и восстановления оксалоацетата одинаков и равняется 35оС.