Использование ионообменной хроматографии для получения гомогенного препарата глутаматдегидрогеназы из проростков пшеницы

Благодаря пятистадийной очистке был получен гомогенный препарат глутаматдегидрогеназы (ГДГ, L-глутамат: НАД(Ф)Н-оксидоредуктаза 1.4.1.3), очищенный в 319.5 раз с удельной активностью 377 Е/мг белка и выходом 3.7%. Обычно очистка энзимов в нашей лаборатории осуществляется по следующей общей схеме: гомогенизация растительного материала (получение экстракта энзима), фракционирование белков-ферментов сульфатом аммония, гель-фильтрация на сефадексе G-25, обеспечивающая обессоливание белков, ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Sephacel, десорбция ферментативной активности осуществлялась градиентом концентрации NaCl (0.15-0.3 М). Последнюю стадию очистки осуществляли путем гель-хроматографии на сефадексе G-200. Известно, что ингибирующее действие на глутаматдегидрогеназу оказывают АТФ и метаболические интермедиаты (глутамат и 2-оксоглутарат). Активация ферментативной активности наблюдается при воздействии АМФ, ионов кальция и магния, а также сульфата аммония. Наибольший эффект из перечня всех хроматографических методов (ионообменная, распределительная, гель-фильтрация и др.) имело использование ДЭАЭ-Sephacel. При этом степень очистки ГДГ составляла более чем в 300 раз. Проведенный ПААГ-электрофорез с последующим специфическим проявлением тетразолиевым методом позволил обнаружить у очищенного белка глутаматдегидрогеназную активность. pH-оптимум полученной ГДГ по реакции восстановительного аминирования составляет 8.5, также как и по реакции окислительного дезаминирования. Были получены кинетические характеристики сродства глутаматдегидрогеназы к субстратам различной природы. Величины константы Михаэлиса для 2-оксоглутарата составляли 2.75, а для глутамата – 14.9, что может говорить о преобладании β-субъединиц в структуре олигомера ГДГ. Анализ этих данных свидетельствует о значительно большем сродстве исследуемого энзима к 2-оксоглутарату.