Исследование параметров каталитического действия глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, выделенной с помощью хроматографических методов, при патологии печени

Целью работы было исследование активности ключевого фермента пентозофосфатного пути – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49), при патологии печени, а также выделение фермента с использованием хроматографических методов и изучение его каталитических свойств. Анализ активности Г6ФДГ осуществляли в сыворотке крови пациентов с алкогольным гепатитом, находящихся на лечении в стационаре. В контрольную группу были включены практически здоровые доноры с нормальными показателями общего и биохимического анализов крови. Экспериментальный токсический гепатит (ЭТГ) индуцировали путем перорального введения CCl4 самцам белых лабораторных крыс (Rattus norvegicus) Wistar. Активность Г6ФДГ определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм. Очистку фермента из печени лабораторных животных осуществляли с помощью фракционирования сульфатом аммония, гель-фильтрации через Sephadex G-25 и G-150, а также ионообменной хроматографии через ДЭАЭ-целлюлозу. Чистоту полученных ферментных препаратов оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Общее количество белка в пробах определяли по методу Лоури. Выявлено, что наряду с существенным возрастанием маркерных показателей патологии печени - аспартатаминотрансферазы (АСАТ) и аланинаминотрансферазы (АЛАТ), происходили изменения активности Г6ФДГ при токсическом гепатите у пациентов и в эксперименте на животных по сравнению с контрольными группами. Применение хроматографических методов для очистки Г6ФДГ из печени крыс в норме и при ЭТГ позволило получить ферментные препараты с удельной активностью 4.13 и 6.53 Е/мг белка; с выходом 8.2 и 8.3%, соответственно, которые были использованы для изучения кинетических свойств. Установлено, что кинетика ферментативной реакции, катализируемой Г6ФДГ, подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен. При ЭТГ наблюдается увеличение скорости ферментативной реакции, сопровождаемое повышением сродства к субстрату и коферменту. Определены константы ингибирования и тип ингибирования для АТP, АDP и NADPH Г6ФДГ из печени крыс в норме и при ЭТГ. Полученные результаты позволяют предположить, что изменение активности Г6ФДГ при токсическом гепатите сопряжено с конформационными перестройками белковой молекулы без изменения ее первичной структуры на фоне интенсификации свободнорадикальных процессов.