Оптимизация методики получения рекомбинантных двухдоменных лакказ

Лакказы (К.Ф. 1.10.3.2) – ферменты из семейства медьсодержащих оксидаз, активный центркоторых содержит 4 атома меди. Лакказы способны окислять широкий спектр органический и неорганических соединений. Ферменты данного класса используют в биотехнологических целях (в целлюлозно-бумажной, текстильной, пищевой промышленности). В структурном отношении лакказыподразделяют на 2 группы: двухдоменные (2д) и трёхдоменные (3д) ферменты. Характерные особенности 2д лакказ – устойчивость к специфичным ингибиторам семейства медьсодержащих оксидаз, а также высокая термостабильность. Окислительно-восстановительный потенциал 2д лакказ ниже потенциала 3д ферментов. Однако он может быть повышен благодаря использованию редоксмедиаторов. Высокая термостабильность и устойчивость к действию ингибиторов – важные критерии отбора ферментов для нужд биотехнологии. Также важным критерием для биотехнологически значимых ферментов является стоимость их производства. Если получение фермента требует значительных затрат, а выход конечного продукта низок, то производство фермента нецелесообразно.Поэтому целью данной работы является оптимизация процесса получения двухдоменных рекомбинантных лакказ, экспрессируемых гетерологично в штамме Escherichia coli, с расчетами стоимости конечного продукта (на примере ферментов SgfSL, SvSL и SaSL, полученных в нашей лаборатории). Ранее три рекомбинантные двухдоменные лакказы были клонированы и  экспрессированы в штамме Escherichia coli M15 (pRep4). В данной работе мы исследовали влияние различных факторов на максимальный выход лакказ: влияние ионов меди, концентрации индуктора, условий культивирования, оптической плотности культуры, и других условий. Было показано, что оптимальная концентрация ионов меди составляет 1 мМ, а оптимальная концентрация индуктора ИПТГ составляет 0,1мМ (при этом отсутствует эффект агрегирования и наблюдается высокий выход ферментов). Мы подтвердили выводы коллег о том, что для получения лакказ, максимально насыщенных ионами меди, необходимы микроаэробные условия культивирования. Без стадии микроаэробного роста удельная активность очищенных ферментов снижается в 2 раза. Было обнаружено, что слишком высокая скорость перемешивания клеток при индукции синтеза лакказ приводит к агрегации ферментов. Скорость перемешивания, при которой лакказы не агрегируют, составляет 50-100 об/мин.Выводы: был разработан и оптимизирован процесс получения двухдоменных бактериальныхрекомбинантных лакказ. Максимальный выход ферментов составил 180 мг белка с литра среды. Фер-мент имел низкую себестоимость (16-32 евро за 1 г белка).         ЛИТЕРАТУРА 1. Baldrian P. // FEMS Microbiol Lett. 2006. Vol. 30. No 2. pp. 215-242.2. Claus H. // Arch Microbiol. 2003. Vol. 179. No 3. pp. 145-150.3. Otto B., Schlosser D. // Planta. 2014. Vol. 240. No 6. pp. 1225-1236.4. Lisov A.V., Zavarzina A.G., Zavarzin A.A., Leontievsky A.A. // FEMS Microbiol Lett.2007. Vol. 275. No 1. pp. 46-52.5. Thurston C.F. // Microbiology. 1994. Vol. 140. pp. 19-26.6. Sterjiades R., Dean J.F., Eriksson K.E. // Plant Physiol. 1992. Vol. 99. No 3. pp. 1162-1168.7. Endo K., Hosono K., Beppu T., Ueda K. // Microbiology. 2002. Vol. 148. pp. 1767-1776.8. Lu L., Zeng G., Fan C., Zhang J. et al. // Appl Environ Microbiol. 2014. Vol. 80. No 11. pp. 3305-3314.9. Minussi R.C., Pastore G.M., Duran N. // Trends Food Sci Tech. 2002. Vol. 13. No 6-7. рр. 205-216.10. Dominguez A., Couto S.R., Sanroman M.A. // World J Microbiol Biotechnol. 2005. Vol. 21. No 4. pp. 405-409.11. Couto S.R., Herrera J.L.T. // Biotechnol Adv. 2006. Vol. 24. No 5. pp. 500-513.12. Trubitsina L.I., Tishchenko S.V., Gabdulkhakov A.G., Lisov A.V. et al. // Biochimie.2015. Vol. 112. pp. 151-159.13. Tishchenko S., Gabdulkhakov A., Trubitsina L., Lisov A. et al. // Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 2015. Vol. 71. pp. 1200-1204.14. Lisov A.V., Trubitsina L.I., Lisova Z.A., Trubitsin I.V. et al. // Process biochemistry. 2019. Vol. 76. pp. 128-135.15. Durao P., Chen Z., Fernandes A.T., Hildebrandt P. et al. // J Biol Inorg Chem. 2008. Vol. 13. No 2. pp. 183-193.16. Gunne M., Urlacher V.B. // PLoS One. 2012. Vol. 7. No 12. pp. e52360.