Translational development of heterodimeric interleukin-15 for immunotherapy of HIV-1 and cancer

Εισαγωγή: Η ετεροδιμερική ιντερλευκίνη-15 (hetIL-15) είναι μία κυτταροκίνη που υποστηρίζει τον πολλαπλασιασμό και την ενεργοποίηση των κυττάρων φυσικών φονέων (ΝΚ) και των Τ κυτταροτοξικών κυττάρων. Αποτελείται από μία διαμεμβρανική πολυπεπτιδική αλυσίδα (IL-15 υποδοχέας α), η οποία αλληλοεπιδρά και σταθεροποιεί την βιοενεργή πολυπεπτιδική αλυσίδα (IL-15). Αυτό το σύμπλεγμα φθάνει στην κυτταρική μεμβράνη, όπου απελευθερώνεται ως βιοενεργή ετεροδιμερική κυτταροκίνη (hetIL-15), κατόπιν πρωτεολυτικής αντίδρασης. Η ανασυνδυασμένη IL-15 και άλλες μορφές της κυτταροκίνης έχουν φανεί ότι οδηγούν στον πολλαπλασιασμό Τ κυττάρων με κυτταροτοξικό φαινότυπο εκτελεστών-μνήμης, και αυξημένη κυτταροτοξική ενεργότητα. Η hetIL-15 και άλλες μορφές της IL-15 έχουν επίσης δείξει θεραπευτική αποτελεσματικότητα σε μοντέλα καρκίνου σε ποντίκια. Η hetIL-15 έχει εισέλθει σε κλινικές δοκιμές για θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου, χορηγούμενη υποδορίως σε σταθερές δόσεις. Στην τοξικολογική μελέτη σε σιμιΐους Macaca mullata (μακάκους), η hetIL- 15 χορηγούμενη σε υψηλές δόσεις εμφάνισε τοξικότητα νωρίς στον θεραπευτικό κύκλο, ενώ η ανοσολογική ενεργοποίηση μειωνόταν προς το τέλους του κύκλου, υποστηρίζοντας την ανάγκη βελτιστοποίησης του θεραπευτικού σχήματος. Η δυνατότητα της hetIL-15 να πληθαίνει τα κυτταροτοξικά κύτταρα την καθιστά ελκυστική για θεραπευτική χρήση σε λοίμωξη από τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV-1), ιδιαίτερα αν τα ενεργοποιημένα κύτταρα διεισδύουν σε ιστούς που αποτελούν την ιϊκή δεξαμενή, όπως τα λεμφαδενικά θυλάκια και τον λεμφικό ιστό σχετιζόμενο με τον γαστρεντερικό σωλήνα (GALT). Για την θεραπεία κακοηθειών, η αποτελεσματικότητα της IL-15 και άλλων φαρμάκων έχουν φανεί να είναι σημαντικές όταν επιτυγχάνεται στόχευση εντός των όγκων. Τα ευκαρυωτικά κύτταρα εκκρίνουν κυστίδια μεγέθους ~100 nm (εξωκυτταρικά κυστίδια, EV), τα οποία δύναται να διαμορφωθούν ώστε να φέρουν θεραπευτικά μόρια. Στο εκκολαπτόμενο πεδίο των θεραπευτικών EV, αυτά τα κυστίδια σχεδιάζονται ως βιολογικά νανοσωματίδια με σκόπο την μεταφορά πολλαπλών θεραπευτικών μορίων σε όγκους και άλλους ιστούς. Στόχοι: Η παρακάτω μελέτη έχει ως σκοπό: (α) την ανάπτυξη βελτιστοποιημένου δοσολογικού σχήματος της hetIL-15, βασιζόμενο στον μηχανισμό δράσης της κυτταροκίνης, ώστε να ελαχιστοποιηθεί η τοξικότητα και να μεγιστοποιηθεί η ανοσολογική ενεργοποίηση, (β) την διερεύνηση της εφαρμοσιμότητας της hetIL-15 ως μέρος ανοσοθεραπευτικής προσέγγισης της θεραπείας λοίμωξης HIV-1, και (γ) την ανάπτυξη των απαραίτητων τεχνολογιών και εργαλείων για την περαιτέρω χρήση των EV ως πλατφόρμα για την μεταφορά της hetIL-15 και άλλων θεραπευτικών μορίων εντός κακοήθων όγκων. Μεθοδολογία: Υγιείς και μολυσμένοι με ιο SHIV μακάκοι υποβλήθηκαν σε θεραπευτικό κύκλο 2 εβδομάδων με αυξανόμενες δόσεις hetIL-15 (2 εώς 64 μg/kg, step-dose), χορηγούμενη υποδορίως ή ενδοπεριτοναϊκά. Τα ζώα θανατώθηκαν στο πέρας της μελέτης. Αίμα συλλέχθηκε καθόλη τη διάρκεια της μελέτης, βιοψίες λεμφαδένων (LN) πάρθηκαν πριν και μετά του θεραπευτικού κύκλου, και δείγματα από πολλαπλά όργανα (συμπεριλαμβανομένου του γαστρεντερικού σωλήνα) ελήφθησαν κατά την νεκροψία. Ζωτικά σημεία, κλινικοεργαστηριακές εξετάσεις, κλινική παρατήρηση, και καθορισμός των φαρμακολογικών επιπέδων της hetIL-15 διεξήχθησαν καθόλη τη διάρκεια της μελέτης. Τα δείγματα ιστών αναλύθηκαν ώς προς την συχνότητα και τον φαινότυπο των ανοσολογικών κυττάρων με κυταρομετρία ροής ή/και με πολυπαραμετρική συνεστιακή μικροσκοπία με ποσοτικοποίηση παρατηρήσεων (Histocytometry). Το ϊικό φορτίο του πλάσματος, καθώς και τα ϊικά νουκλεϊνικά οξέα σχετιζόμενα με κύτταρα ιστών, ποσοτικοποιήθηκαν με qPCR και RT-qPCR χρησιμοποιώντας εκκινητήρες για το γονίδιο SIV gag. Για της μελέτες με EV, δημιουργήθηκε μια νέα μορφή της κυτταροκίνης με την χρήση τεχνολογίας ανασυνδυασμού, η οποία αποτελείται από πρωτεΐνη-σύντηξης των ανθρώπινων hetIL-15 και Lactadherin. Δημιουργήθηκαν κλώνοι της κυτταρικής σειράς HEK293 οι οποίοι μονίμως εκκρίνουν είτε την φυσικού-τύπου κυτταροκίνη ή hetIL-15/Lactadherin, και αναπτύχθηκαν σε καλλιεργητικές φλάσκες ή σε βιοαντιδραστήρα με κοίλες ίνες (με καλλιερητικό μέσω χωρίς ζωικό ορό). EV απομονώθηκαν από το εμπλουτισμένο (από τις κυτταροκαλλιέργειες) καλλιεργητικό μέσω χρησιμοποιώντας συνδυασμούς υπερ(φυγοκέντρησης), διήθησης, διάλυσης, διήθησης εγκάρσιας ροής, και χρωματογραφίας αποκλεισμού μεγέθους. Τα καθαρά EV που προκύπταν αναλύονταν ως προς βιοφυσικές ιδιότητες (ανάλυση ανίχνευσης νανοσωματιδίων, ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης), ως προς βιοχημικές ιδιότητες (Western, ELISA, κυτταρομετρία ροής, ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης με ανοσο-ανίχνευση, φασματογραφία μάζας), και ως προς την βιοενεργότητα in vitro. Η κυτταρική πρόσληψη EV μελετήθηκε in vitro καλλιεργώντας κυτταρικές σειρές ή μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος με φθοριο-σεσημασμένα EV, παρουσία ή απουσία αναστολέων πρόσληψης, και αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Η βιοκατανομή φθοριο-σεσημασμένων EV κατόπιν ενδοφλέβιας έγχυσης μελετήθηκε σε υγιή ποντίκια FVB και σε Balb/c που φέραν όγκους 4T1, και αναλύθηκε με εικονοληψία φθορισμού σε ζωντανά ποντίκια, καθώς και στα απομονωμένα όργανα τους ex vivo. Αποτελέσματα: Το υποδόριο σχήμα step-dose οδήγησε σε λιγότερη τοξικότητα από ότι η χορήγηση σταθερής δόσης 50 μg/kg hetIL-15. Η τοξικότητα αφορούσε σε παροδικό εμπύρετο και μείωση της λευκωματίνης ορού. Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός και η ανοσολογική ενεργοποίηση των κυτταροτοξικών κυττάρων διατηρήθηκε καθόλη τη διάρκεια του θεραπευτικού κύκλου. Το σχήμα ήταν ανεκτό εξίσου καλά σε μακάκους μολυσμένους από SHIV, και οδήγησε σε σημαντική διείσδυση των λεμφαδένων (συμπεριλαμβανομένων των θυλακίων) με πολλαπλασιάζοντα κυτταροτοξικά κύτταρα. Η ενδοπεριτοναϊκή έγχυση της hetIL-15 σε μικρό αριθμό ζώων δεν σχετίστηκε με αυξημένη τοξικότητα, και οδήγησε σε βελτιωμένη ανοσολογική ενεργοποίηση εντώς των μεσεντερικών λεμφαδένων και GALT. Τα ζώα που υπέστησαν στο υποδόριο σχήμα υποβλήθηκαν επιπλέον σε ιολογικές αναλύσεις. Το ιϊκό φορτίο πλάσματος μειώθηκε σε 11 από τα 13 ζώα (3 εώς 176-πλάσια μείωση), όπως και το ιικό RNA στα λεμφαδενικά κύτταρα (10 εώς 103-πλάσια μείωση) και στα μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (3 εώς 100-πλάσια μείωση) σε 4 από τα 4 αναλυθέντα ζώα. Παρατηρήσαμε ότι η ανθρώπινη hetIL-15/Lactadherin αύξησε την παρουσία της κυτταροκίνης σχετιζόμενης με EV κατά 100 φόρες, συγκρινόμενη με την φυσικού-τύπου κυτταροκίνη, και ότι η κυτταροκίνη σχετιζόμενη με τα EV ήταν βιοενεργή in vitro, οδηγώντας στον δοσο- εξαρτώμενο πολλαπλασιασμό της κυτταρικής σειράς ΝΚ92. Το εμπλουτισμένο καλλιεργητικό μέσο από τον βιοαντιδραστήρα εμπεριείχε 40-60 φορές περισσότερα EV ανά μονάδα όγκου σε σχέση με αυτό από τις συμβατικές καλλιεργητικές φλάσκες, και δεν περιείχε πρόσμιξη πρωτεϊνών ζωικού ορού. Ο συνδυασμός διήθησης εγκάρσιας ροής με την χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους απεδείχθη μεθοδολογία ικανή να παράγει μεγάλες ποσότητες καθαρών, βιενεργών EV. Τα ενδοφλεβίως χορηγούμενα EV απομακρύνονταν γρήγορα από τα ηπατικά μακροφάγα των ποντικών. Ανακαλύψαμε πως ο Υποδοχέας Ρακοσυλλέκτης Τύπου Α είναι υπεύθυνος για μεγάλο μέρος της απομάκρυνσης, και αναδείξαμε ότι o αποκλεισμός του υποδοχέα με θειική δεξτράνη μειώνει την ηπατική απομάκρυνση και αυξάνει σημαντικά την κυκλοφορία και την συσσώρευση των χορηγούμενων EV εντός όγκων. Συμπεράσματα: Η χορήγηση hetIL-15 με αυξανόμενες δόσεις (step-dose) σε μακάκους Rhesus αποτελεί ασφαλή τρόπο χορήγησης υψηλών δόσεων της κυτταροκίνης, οδηγώντας σε σημαντικές αυξήσεις της διείσδυσης κυτταροτοξικών κυττάρων στους ιστούς του σώματος, συμπεριλαμβανομένων των ανατομικών τοποθεσιών με σημασία για την θεραπεία HIV-1 και κακοηθειών. Στα μολυσμένα με SHIV ζώα, το υποδόριο σχήμα της hetIL-15 οδήγησε σε μείωση του ιϊκού φορτίου σχετιζόμενο με το αίμα και τους περιφερικούς λεμφαδένες, όμως δεν οδήγησε στην εξάλειψη της λοίμωξης. Η βελτίωση των επιδράσεων της hetIL-15 στους υπόλοιπους ιστούς της ιϊκής δεξαμενής (όπως στους μεσεντερικούς λεμφαδένες και GALT), και η ενσωμάτωση της hetIL-15 σε θεραπευτικό πρωτόκολλο που περιλαμβάνει επιπλέον σκευάσματα (πχ. ουσίες αναστροφής της λανθάνουσας φάσης του HIV-1, αναστολείς σημείων ελέγχου) πιθανώς θα αυξήσει την πιθανότητα επίτευξης λειτουργικής ίασης της λοίμωξης HIV- 1. Παρόμοιες προσεγγίσεις, που να αξιοποιούν την δραστικότητα της hetIL-15 σε συνδυαστικά πρωτόκολλα μπορεί να είναι αποτελεσματικά και στην θεραπεία κακοηθειών. Η στοχευμένη στους όγκους μεταφορά της κυτταροκίνης με χρήση EV που φέρουν μεγάλες ποσότητες της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης-σύντηξης hetIL-15/Lactadherin επίσης μπορεί να αυξήσει την θεραπευτική αποτελεσματικότητα. Η χρήση του πλασμιδίου που σχεδιάσαμε να κωδικοποιεί την ανθρώπινη Lactadherin μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αύξηση επιπλέον θεραπευτικών πρωτεϊνών σε ΕV. Η παραγωγή καθαρών EV από βιοαντιδραστήρα με την χρήση διήθησης εγκάρσιας ροής και χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους είναι αποδοτική μέθοδος για την μελέτη EV στο ερευνητικό εργαστήριο. Επιπλεόν, είναι συμβατή με μεθόδους της ιατροφαρμακευτικής βιομηχανίας (cGMP) και θα μπορούσε να προσαρμοστεί στην μεγάλης- κλίμακας παραγωγής θεραπευτικών EV. Συνεπώς, αυτές οι μέθοδοι μπορεί να είναι ευρέως εφαρμόσιμες στην περαιτέρω μεταφραστική ανάπτυξη των θεραπευτικών EV. Μολονότι η μεταφορά των ΕV σε όγκους μπορεί να περιορίζεται από την απομάκρυνσή τους από τα ηπατικά μακροφάγα κατόπιν ενδοφλέβιας έγχυσης (ιδιαίτερα μέσω αλληλεπίδρασης των ΕV με τους Υποδοχείς Ρακοσυλλέκτες Τύπου Α), ο αποκλεισμός της κυτταρικής πρόσληψης από μακροφάγα είναι εφικτός, και βοηθά την συσσώρευση των EV σε όγκους. Η ανάπτυξη νέων αποκλειστών της κυτταρικής πρόσληψης, η τροποποίηση των EV με μόρια στόχευσης ή απόκρυψης, καθώς και η βαθύτερη κατανόηση των μηχανισμών που καθορίζουν την μοίρα των EV in vivo μπορεί να επιτρέψουν πιο αποτελεσματική μεταφορά. Καθώς η hetIL-15 μελετάται ήδη σε ανθρώπους, τα ευρήματα των μελετών μας δύναται να καθοδηγήσουν τον σχεδιασμό περαιτέρω κλινικών δοκιμών της εν λόγω κυτταροκίνης για την ανοσοθεραπεία λοίμωξης HIV-1 και κακοηθειών.