Genes involved in biosynthesis of hydroxytyrosol in olive fruit and heterologous expression in Arabidopsis thaliana and Saccharomyces cerevisiae

Το ελαιόδενδρο, Olea europaea, είναι ένα ευρέως καλλιεργούμενο είδος, γνωστό για την υψηλή διατροφική αξία του ελαιολάδου που παράγει, πλούσιο σε φαινολικές ενώσεις με αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Ένα από τα πιο σημαντικά αντιοξειδωτικά της ελιάς είναι η υδροξυτυροσόλη (ΥΤ), η οποία επιπλέον έχει αντιφλεγμονώδεις, αντιμικροβιακές. αντι-υπερλιπιδαιμικές ιδιότητες και συνεισφέρει στην άμυνα του φυτού. Το βιοσυνθετικό μονοπάτι της ΥΤ στο ελαιόδενδρο δεν είναι πλήρως αποσαφηνισμένο. Υπάρχουν δύο προτεινόμενες οδοί, οι οποίες ξεκινούν από την τυροσίνη και περιλαμβάνουν τέσσερα ένζυμα, που συνθέτουν διαφορετικούς ενδιάμεσους μεταβολίτες. Υπάρχει ένα αυξανόμενο ενδιαφέρον για την ετερολόγη παραγωγή ΥΤ σε μικροοργανισμούς όπως η ζύμη. Η εισαγωγή βιοσυνθετικών γονιδίων της ελιάς θα μπορούσε να οδηγήσει σε παραγωγή ΥΤ. Καθώς η τυροσίνη είναι η πρόδρομη ένωση της ΥΤ, η αύξηση των ενδογενών επιπέδων τυροσίνης δυνητικά θα ενισχύσει την παραγωγή της ΥΤ. Η ΥΤ εμπλέκεται στη φυτική άμυνα άρα θα είχε ενδιαφέρον η διερεύνηση της πιθανής ανθεκτικότητας σε παθογόνα άλλων φυτών, όπως το Arabidopsis thaliana, που θα παράγουν ετερόλογα ΥΤ. Η ελευρωπαΐνη είναι ένα ακόμα αντιοξειδωτικό της ελιάς. Ανήκει στα σεκοϊριδοειδή, μια κατηγορία φαινολικών ενώσεων, τα οποία παράγονται από τη σεκολογανίνη. Τα βιοσυνθετικά γονίδια της σεκολογανίνης δεν έχουν βρεθεί στην ποικιλία ελιάς Κορωνέικη. Οι στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: α) ο εντοπισμός γονιδίων που δυνητικά εμπλέκονται στα βιοσυνθετικά μονοπάτια της ΥΤ και της ελευρωπαΐνης στην Κορωνέικη μέσω ανάλυσης του μεταγραφώματος, καθώς και η μελέτη της σχετικής γονιδιακής έκφρασης και της συσσώρευσης των αντίστοιχων μεταβολιτών κατά την ωρίμανση του καρπού, β) η τροποποίηση στελεχών ζύμης για την υπερπαραγωγή τυροσίνης, ώστε να χρησιμοποιηθούν για την ετερόλογη βιοσύνθεση ΥΤ και γ) η δημιουργία διαγονιδιακών φυτών Arabidopsis thaliana με γονίδια της ελιάς για την ανασύσταση της βιοσυνθετικής οδού της ΥΤ. Για την επίτευξη των παραπάνω στόχων εφαρμόσθηκαν τεχνικές αλληλούχησης, μεταβολικής μηχανικής και γενετικής. Στον νεαρό καρπό ελιάς ποικιλίας Κορωνέικης εκφράζονται γονίδια που δυνητικά κωδικοποιούν ένζυμα ικανά να σχηματίσουν πάνω από ένα βιοσυνθετικό μονοπάτι της ΥΤ. Στο μεταγράφωμα της ελιάς εντοπίστηκαν επίσης μετάγραφα των γονιδίων που δυνητικά εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της σεκολογανίνης. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των βιοσυνθετικών γονιδίων της ΥΤ και της σεκολογανίνης, καθώς και τα επίπεδα της ΥΤ, της τυροσόλης και της ελευρωπαΐνης, ποσοτικοποιήθηκαν σε πέντε αναπτυξιακά στάδια του καρπού για τέσσερα συναπτά έτη. Η μελέτη τους αποκάλυψε ένα σταθερό πρότυπο, με υψηλότερη έκφραση και ποσότητα στον νεαρό καρπό, και μειούμενη κατά την ωρίμανση. Στη ζύμη τα ενδογενή επίπεδα τυροσίνης θεωρήθηκαν ανεπαρκή για την ετερόλογη παραγωγή ΥΤ, ως εκ τούτου δημιουργήθηκαν νέες κυτταρικές σειρές που παρουσίασαν μέχρι 4,5 φορές άνοδο των επιπέδων ενδοκυττάριας τυροσίνης. Η εισαγωγή βιοσυνθετικών γονιδίων ΥΤ της ελιάς σε ένα νέο στέλεχος ζύμης οδήγησε στην παραγωγή σημαντικών επιπέδων τυροσόλης, ανιχνεύσιμα μόνο στο στελέχος που υπερπαράγει τυροσίνη και φέρει τα διαγονίδια της ελιάς. Η εισαγωγή βιοσυνθετικών γονιδίων της ΥΤ της ελιάς ή ομόλογων βακτηριακών διαγονιδίων στο Arabidopsis thaliana οδήγησε στη δημιουργία 28 διαγονιδιακών φυτών, 3 διαφορετικών γενοτύπων. Το προφίλ των μεταβολιτών από τα διαγονιδιακά φυτά συγκρίθηκε με φυτά αγρίου τύπου και εντοπίστηκαν νέες ενώσεις, αλλά καμία δεν ταυτοποιήθηκε ως τυροσόλη ή ΥΤ.