Απομόνωση και λειτουργικός χαρακτηρισμός in vitro και in vivo γονιδίων που κωδικοποιούν για συνθετάσες διτερπενίων

Η παρούσα διατριβή, είχε ως κύριο στόχο τη βαθύτερη κατανόηση, την απομόνωση και το λειτουργικό χαρακτηρισμό γονιδίων, που συμμετέχουν στο βιοσυνθετικό μονοπάτι λαβδανικών διτερπενίων στο φυτό C. creticus (λαδανιά). Από πειράματα, που πραγματοποιήθηκαν, βρέθηκαν, απομονώθηκαν και μελετήθηκαν τέσσερα πιθανά γονίδια. Επιπλέον συσχετίστηκε η έκφραση γονιδίων βιοσύνθεσης λαβδανικών διτερπενίων με την παραγωγή των αντίστοιχων ουσιών σε διάφορους ιστούς της λαδανιάς. Χημική ανάλυση της ρητίνης (C. creticus subsp. creticus) έδειξε ότι αποτελείται κυρίως από λαβδανικά διτερπένια και λιγότερο από μονοτερπένια ή σεσκιτερπένια. Από το σύνολο των χημικών αναλύσεων με αέριο χρωματογράφο (GC-MS) στον ιστό της λαδανιάς ταυτοποιήθηκαν για πρώτη φορά η cis-αβιενόλη, η νεοαβιενόλη, η λαριξόλη καθώς και δυο άγνωστες ουσίες λαβδανικής δομής ουσίες που ομοιάζουν με τη λαβδα-7,13(Ε)-διεν-15-όλη. Επίσης βρέθηκε ότι ο καρπός του υποείδους C. creticus subsp. creticus παράγει μεγαλύτερες ποσότητες λαβδανικών διτερπενίων, από ότι ο καρπός του υποείδους C. creticus subsp. eriocephalus. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των γονιδίων αυτών οδήγησε στην αναγνώριση της λειτουργίας τους. Συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι τα γονίδια CcLDDS1 και CcLDDS2 κωδικοποιούν τις συνθετάσες της διφωσφορικής λαβδα-7,13(Ε)-διεν-15-όλης 1 και 2 (endo-7,13-CPS). Επιπλέον, χαρακτηρίστηκε το γονίδιο CcKS, που συμμετέχει στο μονοπάτι βιοσύνθεσης της γιββερελλίνης, καθώς παράγει ent-καουρένιο. Τέλος, χαρακτηρίστηκε η λειτουργία για το γονίδιο CcLAT, που κωδικοποιεί την ακετυλοτρανσφεράση μέσω της οποίας παράγονται οι οξικοί εστέρες των λαβδανικών διτερπενίων της λαβδα-7,13(E)-διεν-15-όλης καθώς και της λαβδα-13(Ε)-8α,15-διόλης. Η έκφραση των γονιδίων CcCLS, CcLDDS1, CcLDDS2, CcKS και CcLAT ελέγχθηκε σε ιστούς του φυτού C. creticus subsp. creticus, όπου και βρέθηκε να εμφανίζουν υψηλή έκφραση στα νεαρά φύλλα (1ου και 2ου αναπτυξιακού σταδίου). Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε ότι τα νεαρά φύλλα συγκεντρώνουν την υψηλότερη έκφραση και παραγωγή των λαβδανικών διτερπενίων.