Bacterial hydrolases of thermophilic origin and their application in plant biomass valorisation

Η παρούσα διδακτορική διατριβή εντάσσεται στο γενικότερο πλαίσιο των βιοδιυληστηρίων δεύτερης γενιάς και ειδικότερα στην αξιοποίησης των θερμόφιλων μικροοργανισμών και των προϊόντων τους στη βιομετατροπή της λιγνοκυτταρινούχου βιομάζας σε βιοκαύσιμα και άλλα ενδιάμεσα χημικά. Πιο συγκεκριμένα, η εργασία εστιάστηκε στην υδρόλυση της κυτταρίνης και της ξυλάνης από 103 θερμόφιλα βακτηριακά στελέχη τα οποία συλλέχθηκαν από το ηφαίστειο της Σαντορίνης (Meintanis, Chalkou et al. 2006). Τα στελέχη αυτά στην πλειοψηφία τους ανήκουν στο γένος Geobacillus και εμφανίζουν ξυλανολυτική ικανότητα ενώ ορισμένα διαθέτουν επιπλέον την ικανότητα υδρόλυσης της κυτταρίνης (Stathopoulou, Galanopoulou et al. 2012).Υπό αυτό το πλαίσιο, η διδακτορική εργασία μπορεί να υποδιαιρεθεί σε τέσσερα επί μέρους τμήματα. Τα πρώτα τρία είναι αλληλένδετα μεταξύ τους και σχετίζονται με την αποικοδόμηση της κυτταρίνης και της ξυλάνης από τα στελέχη Geobacillus που απομονώθηκαν από το ηφαίστειο της Σαντορίνης. Στο τελευταίο τμήμα,-το οποίο επίσης σχετίζεται με την αποικοδόμηση της κυτταρίνης από τους γεωβάκιλλους,- επιλέξαμε ένα διαφορετικό στέλεχος, το στέλεχος G. stearothermophilus T-1, για το οποίο το γονιδίωμα είναι γνωστό, το ξυλανολυτικό του σύστημα είναι εκτενώς μελετημένο και επιπλέον έχουν ήδη αναπτυχθεί τα κατάλληλα εργαλεία μετασχηματισμού του (Shulami, Zaide et al. 2007).Ως σημείο αφετηρίας, επιλεγμένα στελέχη από το ηφαιστειακό ενδιαίτημα της Σαντορίνης ελέγχθηκαν για γονίδια που κωδικοποιούν κυτταρινολυτικά και ξυλανολυτικά ένζυμα. Ο εντοπισμός των επιθυμητών γονιδίων πραγματοποιήθηκε με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και χρήση κατάλληλων μορίων εκκινητών (primers). O σχεδιασμός των primers, βασίστηκε στις συντηρημένες περιοχές της αμινοξικής αλληλουχίας όλων των βιοχημικά χαρακτηρισμένων ξυλανολυτικών και κυτταρινολυτικών ενζύμων του γένους Geobacillus αλλά και συγγενικών ειδών τα οποία βρίσκονται κατατεθειμένα στη βάση δεδομένων CAZy (www.cazy.org). Η παραπάνω πορεία, οδήγησε στον εντοπισμό δύο ξυλανασών της οικογένειας γλυκοσιδικών υδρολασών (GH) 10, τριών β-ξυλοσιδασών των οικογενειών GH39, GH43 και GH52, μίας β-P-γλυκοζιδάσης της οικογένειας GH1, και μίας ενδογλυκανάσης της οικογένειας GH5. Ο βιοχημικός χαρακτηρισμός των ενζύμων αυτών, επιβεβαίωσε την αντίστοιχη ξυλανολυτική ή κυτταρινολυτική τους δράση. Επιπλέον, φάνηκε πως τα ένζυμα αυτά δρουν σε ουδέτερο έως ελαφρώς όξινο περιβάλλον, παρουσιάζουν ιδιαίτερη θερμοσταθέροτητα στους 60 και 65 ˚C ενώ εμφανίζουν μέγιστη ενεργότητα μεταξύ 60 ˚C και 70 ˚C. Στο δεύτερο τμήμα της διδακτορικής διατριβής, η μία ξυλανάση GH10, η β-ξυλοζιδάση GH52 και η ενδογλυκανάση GH5 που κλωνοποιήθηκαν στο προηγούμενο στάδιο της διδακτορικής διατριβής και επιπλέον μία β-γλυκοζιδάση από το βακτήριο Caldicellulosiruptor saccharolyticus (DSMZ 8903) χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή ενός κυτταρινοσώματος ικανού να δρά σε υψηλές θερμοκρασίες. Στα ένζυμα αυτά εισήχθηκε μια εξειδικευμένη επικράτεια αγκίστρωσης (dockerin) έτσι ώστε το προκύπτον χιμαιρικό ένζυμο να είναι ικανό να προσδεθεί στην αντίστοιχη επικράτεια σύνδεσης (cohesin) της πρωτεΐνης στήριξης (scafoldin) του κυτταρινοσώματος. Το σύμπλοκο που προέκυψε, αποδείχτηκε ότι παραμένει σταθερό στους 60 ˚C για τουλάχιστον έξι ώρες επώασης και οτι στο συγκεκριμένο χρονικό διάστημα, υδρολύει το άχυρο καλαμποκιού έως και 66% πιο αποδοτικά σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ελεύθερα ένζυμα.(Galanopoulou, Moraïs et al. 2016). H παρούσα εργασία παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς περιγράφει για πρώτη φορά την κατασκευή θερμοκυτταρινοσωμάτων και αποδεικνύει την λειτουργικότητα τους (Galanopoulou, Moraïs et al. 2016).Τα παραπάνω ανοίγουν το δρόμο για την αξιοποίηση των δομών αυτών σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές που απαιτούν υψηλές θερμοκρασίες.Το τρίτο μέρος της παρούσας εργασίας αφορά στην ανάλυση του γονιδιώματος ενός από τα απομονωθέντα στελέχη του ηφαιστείου της Σαντορίνης, του στελέχους “Geobacillus icigianus SP50”. Η μελέτη του συγκεκριμένου στελέχους, παρουσιάζει ενδιαφέρον για δύο λόγους: Αρχικά, ο κυτταρινολυτικός φαινότυπος είναι σπάνιος και όχι καλά μελετημένος για το γένος των γεωβακίλλων. Δεύτερον, το στέλεχος “Geobacillus icigianus SP50” ήταν το μοναδικό στη συλλογή, στο οποίο εντοπίστηκε το γονίδιο της ενδογλυκανάσης GH5 που χαρακτηρίστηκε στο πρώτο μέρος της εργασίας. Από την ανάλυση του γονιδιώματος του εν λόγω στελέχους, εκτός από το γονίδιο της GH5 κυτταρινάσης, εντοπίστηκαν τέσσερα επιπλέον γονίδια: το γονίδιο ενός μεταγραφικού ρυθμιστή της οικογένειας LacI καθώς και τρία γονίδια τα οποία κωδικοποιούν για έναν ΑTP-εξαρτώμενο μεταφορέα ολιγοσακχαριτών. Προτείνουμε πως αυτά τα πέντε γονίδια μαζί αποτελούν μία ομάδα γονιδίων υπεύθυνη για την αποικοδόμηση και πρόσληψη ενός μεγάλου εύρους β-D-γλυκανών από τα κύτταρα. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι τα επιμέρους γονίδια της συγκεκριμένης ομάδας, δεν εντοπίστηκαν σε κανένα άλλο γονιδίωμα του γένους Geobacillus ενώ αντίθετα, σημαντικά συντηρημένα εμφανίστηκαν στο γονιδίωμα αντιπροσώπων διαφορετικών βακτηριακών γενών (Thermicanus aegyptius) αλλά και οικογενειών (Paenibacillus elgii). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η συγκεκριμένη ομάδα γονιδίων ενσωματώθηκε, πιθανά, στο γονιδίωμα του ‘Geobacillus icigianus SP50’ μέσω οριζόντιας μεταφοράς.Tέλος και το τελευταίο κομμάτι της διδακτορικής διατριβής, επικεντρώθηκε στη διάσπαση της κυτταρίνης από το γένος Geobacillus. Πιο συγκεκριμένα, επιχειρήθηκε η μετατροπή του μη κυτταρινολυττικού στελέχους G. stearothermophilus T-1 σε κυτταρινολυτικό μέσω ετερόλογης έκφρασης μίας κυτταρινάσης του βακτηρίου Thermobifida fusca YX. Η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε βασίστηκε σε πρωτόκολλα μετασχηματισμού του συγκεκριμένου στελέχους με ένα παράγωγο του πλασμιδιακού φορέα pNW33N (Zeigler 2001, Zeigler 2002, Shulami, Shenker et al. 2014). Ο προκύπτον μικτός φαινότυπος είναι ιδιαίτερης βιοτεχνολογικής σημασίας καθώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε υψηλής θερμοκρασίας βιομετατροπές ενός σταδίου.Από το σύνολο των επιμέρους τμημάτων της διατριβής που αναλύθηκαν παραπάνω, θεωρούμε ότι προκύπτουν ερωτήματα που χρήζουν περαιτέρω μελέτης:Σε ενζυμικό επίπεδο, είναι γνωστό ότι οι γεωβάκιλοι διαθέτουν μία πληθώρα ενζύμων τα οποία δρουν βοηθητικά στην αποικοδόμηση της ημικυτταρίνης. Τα ένζυμα αυτά θα μπορούσαν να κλωνοποιηθούν και να χαρακτηριστούν βιοχημικά έτσι ώστε να εκτιμηθεί η συνεργιστική δράση τους στην αποτελεσματικότερη αποικοδόμηση της λιγνοκυτταρίνης.Η δημιουργία των θερμοκυτταρινοσωμάτων και η αποτελεσματική ικανότητα υδρόλυσης αυτών σε υψηλές θερμοκρασίες, επιτρέπει την εξαγωγή μίας σειράς υποθέσεων οι οποίες θα μπορούσαν να εξεταστούν. Μεταξύ αυτών, ιδιαίτερο ενδιαφέρον για το εργαστήριο μας, έχει η ένταξη τους σε βιοδιυλιστήρια ενός σταδίου για την παραγωγή αιθανόλης.Όσον αφορά το κυτταρινολυτικό στέλεχος ‘Geobacillus icigianus SP50’, ένας από τους άμεσους στόχους μας είναι η διερεύνηση της ρύθμισης έκφρασης της β-D-γλυκανολυτικής ομάδας. Στην ίδια κατεύθυνση, θα μπορούσε να ενταχθεί το γενετικά τροποποιημένο στέλεχος G. stearothermophilus T-1 για τη χρήση του σε διεργασίες υδρόλυσης της λιγνοκυτταρίνης ενός σταδίου. Ως προς την περαιτέρω βελτιστοποίηση του στελέχους, άμεσος στόχος είναι η ενσωμάτωση του υπεύθυνου τμήματος DNA για τον διάσπαση της κυτταρίνης, στο γονιδίωμα του μικροοργανισμού. Τέλος, ιδιαίτερο ενδιαφέρον θα είχε η ανάπτυξη της κατάλληλης μεθοδολογίας για το γενετικό χειρισμό των βακτηριακών στελεχών τα οποία έχουν απομονωθεί από το ηφαίστειο της Σαντορίνης έτσι ώστε να μελετηθεί εκτενέστερα ο υπάρχον φαινότυπός τους ή να τροποποιηθεί επιπλέον έτσι ώστε να ενταχθούν σε διάφορες βιοτεχνολογικές διεργασίες.