Μελέτη της βιοτεχνολογικής αξιοποίησης και βιοκαταλυτικής συμπεριφοράς του μικροφύκους Nannochloropsis oceanica

Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε η βιοτεχνολογική αξιοποίηση και η βιοκαταλυτική συμπεριφορά του μικροφύκους Nannochloropsis oceanica CCMP1779. Εξετάσθηκε ο ρόλος της αρχικής τιμής του pH της καλλιέργειας, της φωτοπεριόδου, της σύστασης του θρεπτικού μέσου καλλιέργειας, της συγκέντρωσης του όξινου ανθρακικού νατρίου (NaHCO3) και του νιτρικού νατρίου (NaΝO3) καθώς και της συνδυασμένης επίδρασης αυτών, στην παραγωγή βιομάζας και λιπιδίων και στη βιοσύνθεση της χλωροφύλλης και των επιμέρους λιπαρών οξέων. H παραγωγή της βιομάζας και η συσσώρευση των λιπιδίων και της χλωροφύλλης ευνοήθηκαν όταν το μικροφύκος N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο με αρχική τιμή pH 8.0. Κατά την καλλιέργεια του μικροφύκους σε συνεχές φως, βρέθηκε η μέγιστη παραγωγή βιομάζας, ενώ το υψηλότερο λιπιδικό περιεχόμενο υπολογίσθηκε όταν η φωτοπερίοδος ρυθμίστηκε σε 16:8h φως:σκότος. Επιπλέον, διαπιστώθηκε ότι όταν το μικροφύκος καλλιεργήθηκε στο θρεπτικό μέσο F/2 παρουσία όλων των απαραίτητων συστατικών και βιταμινών, επετεύχθη η υψηλότερη συγκέντρωση βιομάζας. Το λιπιδικό περιεχόμενο βρέθηκε κατά 10% αυξημένο όταν ο μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε θρεπτικό μέσο απουσία του νιτρικού νατρίου. Ενδιαφέρον παρουσίασε η μελέτη του ρόλου της σύστασης του θρεπτικού μέσου στη συγκομιδή του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779 με τη χρήση μαγνητικών σωματιδίων Fe3O4. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υψηλότερη απόδοση συγκομιδής της βιομάζας επετεύχθη όταν εξαιρέθηκε από την καλλιέργεια η κύρια πηγή φωσφόρου (NaH2PO4). Όταν ο μικροοργανισμός N. oceanica CCMP1779 καλλιεργήθηκε υπό αυξανόμενες αρχικές συγκεντρώσεις NaHCO3 (0.5 έως 5.0 g/L) και σταθερή αρχική συγκέντρωση NaΝO3, παρατηρήθηκε ότι ο τετραπλασιασμός της συγκέντρωσης του NaHCO3 (από 0.5 g/L στα 2.0 g/L) οδήγησε σε 1.9 φορές μεγαλύτερη συσσώρευση βιομάζας, ενώ το λιπιδικό περιεχόμενο βρέθηκε ίσο με 32.2 % επί της ξηρής βιομάζας. Αντίστοιχα, διαπιστώθηκε ότι η αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης NaΝO3 (από 0 σε 0.1125 g/L) οδήγησε σε βελτίωση της παραγωγής βιομάζας κατά 54%, ενώ το λιπιδικό περιεχόμενο μειώθηκε από 41.6% σε 31.2%. Στη συνέχεια, με τη μεθοδολογία της επιφανειακής απόκρισης διερευνήθηκε η συνδυασμένη επίδραση της συγκέντρωσης του NaHCO3 και του NaΝO3 στην παραγωγή βιομάζας, χλωροφύλλης, λιπιδίων και επί μέρους λιπαρών οξέων. H παραγωγή βιομάζας ευνοήθηκε όταν ο μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε αρχικές συγκεντρώσεις NaHCO3 και NaΝO3 ίσες με 2.3 και 0.075 g/L, ενώ η υψηλότερη περιεκτικότητα σε λιπίδια (44.65%) καταγράφηκε σε χαμηλές συγκεντρώσεις της πηγής άνθρακα και αζώτου (0.189 και 0.075 g/L αντίστοιχα). Το προφίλ των λιπαρών οξέων (FAS) βρέθηκε ότι κυριαρχείται από κορεσμένα (SFAs) και μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (MUFAs), τα οποία αποτελούν το 88-95% των συνολικών λιπαρών οξέων, ενώ τα πολυακόρεστα λιπαρά (PUFAs) αντιπροσωπεύουν το 5-11%. Η βελτιστοποίηση που προέκυψε βασιζόμενη στο κεντρικό πειραματικό σχεδιασμό έδειξε ότι ο συνδυασμός των 1.3 g/L NaHCO3 και 0.06 g/L NaNO3 μεγιστοποιεί τη συσσώρευση των λιπαρών οξέων και το περιεχόμενο σε MUFAs, ενώ οδηγεί στην ελάχιστη περιεκτικότητα σε PUFAs και εικοσαπενταενοϊκό οξύ (EPA). Ακολούθησε κλιμάκωση μεγέθους με τη καλλιέργεια του N. oceanica CCMP1779 σε φωτοβιοαντιδραστήρα όγκου 5L όπου η παραγωγή ξηρής βιομάζας βρέθηκε ίση με 1.47 g/L. Στα πειραματικά αποτελέσματα συγκαταλέγεται και η δυνατότητα αξιοποίησης του μικροοργανισμού σε αντιδράσεις βιοκατάλυσης με την μορφή ολοκλήρων κυττάρων ή κυτταρικών μεμβρανών (αντιδράσεις υδρόλυσης και εστεροποίησης). Αρχικά, προσδιορίστηκε η τοπολογία των ενζυμικών δράσεων και η μέγιστη δραστικότητα εντοπίστηκε στις κυτταρικές μεμβράνες (CDLA) του μικροοργανισμού. Σε ότι αφορά τα βιοχημικά χαρακτηριστικά, το CDLA δρα βέλτιστα σε συνθήκες pH 7.0 και 50 oC. Επίσης, επέδειξε σταθερότητα παρουσία διαφορετικών οργανικών διαλυτών ενώ διατήρησε υψηλότερη δραστικότητα σε μη-πολικούς διαλύτες και συγκεκριμένα το n-οκτάνιο (71%) έπειτα από 6 ώρες επώασης. Η επίδραση διαφόρων μεταλλικών ιόντων όπως του μαγγανίου (Mn2+) ενίσχυσε τη δραστικότητα κατά 68.25%. Όταν εξετάσθηκε η επίδραση επιφανειοδραστικών ουσιών, προέκυψε ότι η παρουσία της αμφιτεριονικής (CHAPS) και της μη-ιονικής επιφανειοδραστικής ουσίας (Triton Χ-100) παρεμπόδισε τη λιπολυτική δράση του ενζύμου και παράλληλα δεν κατέστη δυνατή η αποδέσμευσή του από την κυτταρική μεμβράνη. Μελετήθηκε στη συνέχεια η υδρολυτική εξειδίκευση του έναντι εστέρων της παρα-νιτροφαινόλης με λιπαρά οξέα διαφορετικού μήκους ανθρακικής αλυσίδας (C2:0-C16:0) και βρέθηκε η προτίμηση του στον εστέρα της παρα – νιτρο – φαινόλης με παλμιτικό οξύ. Η μέγιστη ταχύτητα της αντίδρασης (vmax) ήταν ίση με 0.138, 0.257 και 0.054 mmole pNP/mg protein/min, αντίστοιχα για τους τρεις εστέρες της παρα – νιτρο – φαινόλης με καπρυλικό, λαυρικό και παλμιτικό οξύ και η σταθερά Michaelis-Menten (Km) ίση με 0.352, 0.874 και 0.051 mM. Οι σταθερές παρεμπόδισης (KI) για τους εστέρες της παρα – νιτρο – φαινόλης με λαυρικό και παλμιτικό οξύ βρέθηκαν ίσες με 0.185 και 0.898 mM, αντίστοιχα. Ο προσδιορισμός της λιπολυτικής ικανότητας των ολόκληρων κύτταρων, έδειξε ότι το ενζυμικό σκεύασμα παρουσίασε μεγαλύτερη εξειδίκευση σε υποστρώματα με μικρού μήκους ανθρακική αλυσίδα (εστέρας της παρα – νιτρο – φαινόλης με βουτυρικό οξύ) και η βελτιστη τιμή δράσης ήταν το pH 7.0. Επίσης εμφάνισε θερμοσταθερότητα σε υψηλές θερμοκρασίες ενώ η κατεργασία του με επιφανειοδραστικές ουσίες (SDS, Triton X-100, CHAPS) προκάλεσε απώλεια της ενζυμικής δραστικότητας. Τέλος, μελετήθηκε η δυνατότητα αξιοποίησης του μικροοργανισμού σε αντιδράσεις εστεροποίησης λιπαρών οξέων με πρωτοταγείς αλκοόλες καταλυόμενες από το CDLA. Μελετήθηκε η συγκέντρωση του ενζυμικού σκευάσματος, η ταχύτητα ανάδευσης, η επίδραση της θερμοκρασίας στην αντίδραση καθώς και η επίδραση του μήκους της ανθρακικής αλυσίδας των πρωτοταγών αλκοολών (μεθανόλη, αιθανόλη, n-προπανόλη και n-βουτανόλη). Η αντίδραση εστεροποίησης του παλμιτικού οξέος με την αιθανόλη σε η-οκτάνιο καταλυόμενη από το CDLA φάνηκε να ακολουθεί μηχανισμό πινγκ-πονγκ, χωρίς αναστολή από το υπόστρωμα (εντός της συγκεκριμένης περιοχής συγκεντρώσεων υποστρωμάτων που εξετάσθηκαν). Οι κινητικές σταθερές της αντίδρασης εστεροποίησης βρέθηκαν ίσες με vmax=7.02•10-4 mmol εστέρα/g Ε.Σ./h, Κm,παλμιτικού οξέος=86.96 mM και Κm,αιθανόλης=341.71 mM. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ιδιότητες του ενζυμικού συστήματος το οποίο βρίσκεται ακινητοποιημένο στις κυτταρικές μεμβράνες, το καθιστούν ένα ενδιαφέρον σύστημα για περαιτέρω διερεύνηση, ενώ για πρώτη φορά πραγματοποιήθηκε επιτυχημένη προσπάθεια μελέτης των ενζυμικών δράσεων του μικροφύκους N. oceanica CCMP1779.