Φαιά σήψη πυρηνοκάρπων

Η φαιά σήψη είναι η καταστρεπτικότερη ασθένεια των πυρηνόκαρπων που προκαλείται από είδη του γένους Monilinia. Σκοπός του 1ου ερευνητικού κεφαλαίου της διατριβής ήταν η διερεύνηση της συχνότητας παρουσίας των διαφορετικών ειδών του γένους Monilinia σε άνθη και καρπούς πυρηνοκάρπων στην Ελλάδα. Από τις 1433 απομονώσεις που συλλέχθηκαν από οπωρώνες που βρίσκονται στις κυριότερες περιοχές παραγωγής πυρηνόκαρπων στην Ελλάδα, ανιχνεύθηκαν δύο είδη, ο Monilinia laxa και ο M. fructicola, σε συχνότητες 59 και 41% αντίστοιχα. Ο M. fructicola βρέθηκε σε υψηλότερη συχνότητα σε καρπούς, ενώ ο M. laxa βρέθηκε σε παρόμοια συχνότητα, σε άνθη και καρπούς. Με σκοπό τη διερεύνηση των παραμέτρων που εμπλέκονται σε αυτές τις διαφορές, μετρήθηκε η μολυσματικότητα απομονώσεων των δύο ειδών σε πέταλα και σε καρπούς ξενιστών τους καθώς και η επίδραση της θερμοκρασίας στη μυκηλιακή τους αύξηση. Τα στελέχη του M. fructicola βρέθηκαν περισσότερο μολυσματικά και εμφάνισαν υψηλότερο ρυθμό αύξησης στις υψηλές θερμοκρασίες, ενώ τα στελέχη του M. laxa ήταν περισσότερο προσαρμοσμένα στις χαμηλές θερμοκρασίες, γεγονός που θα μπορούσε να εξηγήσει την επικράτηση του M. laxa την περίοδο της ανθοφορίας εξαιτίας των χαμηλότερων θερμοκρασιών που επικρατούν εκείνη την περίοδο. Στη συνέχεια με σκοπό τη διερεύνηση της πιθανής εξειδίκευσης των πληθυσμών M. fructicola και M. laxa σε διαφορετικούς ξενιστές πυρηνοκάρπων και όργανα προσβολής, πραγματοποιήθηκε μελέτη γενετικής παραλλακτικότητας 145 στελεχών του M. fructicola και 156 στελεχών του M. laxa, που συλλέχθηκαν από δύο διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας, με τη χρήση των δεικτών ενδο-επαναλαμβανόμενων απλών ακολουθιών (Intersimple-sequence repeat markers). Οι πληθυσμοί του M. fructicola εμφάνισαν υψηλότερη γενετική ποικιλομορφία σε σύγκριση με τους πληθυσμούς του M. laxa. Τα επίπεδα της γενετικής παραλλακτικότητας ήταν παρόμοια μεταξύ των πληθυσμών που απομονώθηκαν από προσβεβλημένα άνθη και καρπούς και για τα δύο είδη. Επιπλέον, η κατασκευή ενός δενδρογράμματος με βάση την γενετική απόσταση (ανάλυση Nei), έδειξε πως τα στελέχη του M. fructicola από ροδάκινο και βερίκοκο καθώς και τα στελέχη από κεράσι και δαμάσκηνο, ομαδοποιήθηκαν στους ίδιους κλάδους, ενώ η ομαδοποίηση των στελεχών του M. laxa, με βάση τον ξενιστή προέλευσής τους δεν ήταν δυνατή. Παράλληλα, η ανάλυση του δείκτη σύζευξης έδειξε την απουσία γενετικού ανασυνδυασμού και για τα δύο είδη. Τα παραπάνω δεδομένα, ενίσχυσαν την υπόθεση της μακράς παρουσίας του M. fructicola στην Ελλάδα και παρείχαν αποδείξεις εξειδίκευσης των πληθυσμών του M. fructicola με βάση τον ξενιστή προέλευσής τους. Στο 4ο κεφάλαιο αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε μια νέα μέθοδος ταυτοποίησης ειδών του γένους Monilinia, που στηρίζεται στην χρήση της ανάλυσης υψηλής διακριτικής ικανότητας καμπυλών τήξης (HRM). Η φαιά σήψη προκαλείται από διάφορα είδη του γένους Monilinia spp., συμπεριλαμβανομένων των M. laxa, M. fructicola, M. fructigena, M. polystroma, M. mumecola και M. yunnanensis. Στο παρελθόν η ταυτοποίηση των παθογόνων αιτιών της φαιάς σήψης στηριζόταν κυρίως σε διαφοροποιήσεις ως προς τα μορφολογικά χαρακτηριστικά μεταξύ των διαφόρων ειδών, ενώ αργότερα αναπτύχθηκαν και μοριακές μέθοδοι που ωστόσο απαιτούσαν την απομόνωση του παθογόνου από τους μολυσμένους ιστούς. Σχεδιάστηκαν δύο ζεύγη εκκινητών, το πρώτο για την ταυτοποίηση και διαχωρισμό των ειδών και το δεύτερο για την ανίχνευση του παθογόνου καραντίνας M. fructicola, με βάση τις αλληλουχίες ενός εσονίου στο γονίδιο του κυτοχρώματος b (cytb) από στελέχη των προαναφερθέντων ειδών. Για να καλυφθεί η φυσική παραλλακτικότητα εντός των ειδών, χρησιμοποιήθηκαν στελέχη από διάφορους ξενιστές και διαφορετικές ηπείρους, ενώ η εξειδίκευση και ευαισθησία της μεθόδου των εκκινητών της ανάλυσης HRM επαληθεύθηκε σε αντιδράσεις με DNA μυκήτων μη-στόχων καθώς και με τη χρήση γνωστών συγκεντρώσεων DNA των παθογόνων. Αυτή η νέα τεχνική παρείχε τη δυνατότητα της γρήγορης ταυτοποίησης στενά συγγενικών ειδών του Monilinia, ενώ επιπλέον διαχώρισε τον M. fructicola, ένα παθογόνο καραντίνας για την Ε.Ε., από άλλα κοινά παθογόνα ή σαπροφυτικούς μύκητες που αναπτύσσονται στους καρπούς των πυρηνοκάρπων. Σκοπός του τελευταίου κεφαλαίου ήταν ο πρωτεομικός χαρακτηρισμός των καρπών δύο ποικιλιών ροδακινιάς, των "Rich Lady" και "Royal Glory", που διαφέρουν ως προς το βαθμό ευπάθειάς τους στη φαιά σήψη, με τη χρήση της τεχνικής της δισδιάστατης ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακριλαμίδης, (2D-SDS-PAGE). Ανιχνεύθηκαν περισσότερες από 250 πρωτεΐνες (Ρ<0,05), ενώ σε 120 από αυτές, καταγράφηκε διαφοροποίηση (τουλάχιστον διπλασιασμός ή υποδιπλασιασμός) στην έκφρασή τους σε σχέση με τον αμόλυντο μάρτυρα. Η κατηγοριοποίηση των πρωτεϊνών με βάση τον λειτουργικό τους ρόλο, έδειξε πως στην ανθεκτική ποικιλία "Royal Glory" παρατηρήθηκε αύξηση των πρωτεϊνών που σχετίζονται με την άμυνα στους καρπούς που δέχθηκαν μόλυνση, σε σχέση με τους καρπούς του μάρτυρα, ενώ στην "Rich Lady" παρατηρήθηκε μείωση των πρωτεϊνών της ίδιας λειτουργίας, στους καρπούς που δέχθηκαν μόλυνση σε σχέση με τους καρπούς του μάρτυρα. Για την επαλήθευση των πρωτεομικών δεδομένων πραγματοποιήθηκε μια RT-qPCR με σκοπό τη μέτρηση του επιπέδου έκφρασης 6 τυχαία επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με την άμυνα των καρπών.