Λειτουργική διάκριση των ισομορφών TAp73 στην ογκογένεση

Το γονίδιο p73, μαζί με το p63, ανήκει στην οικογένεια του γονιδίου p53. Συνθέτει μια πληθώρα ισομορφών, οι οποίες κατατάσσονται σε δυο ομάδες, τις ογκοκατασταλτικές ΤΑ ισομορφές που επάγονται από τον P1 υποκινητή και περιλαμβάνουν την ΤΑ περιοχή, και τις ογκογόνες DN ισομορφές οι οποίες επάγονται από τον εσωτερικό P2 υποκινητή. Η ισορροπία μεταξύ των ισομορφών αυτών μπορεί να καθορίσει και την μοίρα του κυττάρου. Οι ισομορφές ΤΑp73 περιλαμβάνουν ένα αριθμό παραλλαγών (TAp73α, TAp73β, TAp73γ, TAp73δ, TAp73ε, TAp73ζ and TAp73η) που παράγονται λόγω του εναλλακτικού ματίσματος στο καρβοξυτελικό άκρο. Οι ισομορφές ΤΑp73 διαφέρουν ως προς την μεταγραφική τους δραστηριότητα, όπως προκύπτει από την αποτελεσματικότητά τους να ενεργοποιούν ένα κλασσικό στόχο του γονιδίου p53, το p21Waf 1/Cip1, που αποτελεί έναν σημαντικό στοιχείο της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου. Κάθε μία από τις ισομορφές ΤΑp73 όχι μόνο ενεργοποιεί σε διαφορετικό βαθμό τα ίδια γονίδια, αλλά φαίνεται να διαθέτουν διακριτούς μεταγραφικούς στόχους. Στοιχεία για τις πιο μελετημένες ισομορφές (TAp73α και TAp73β) τονίζουν σαφώς ότι, τουλάχιστον αυτές οι ισομορφές, έχουν αντίθετες επιδράσεις στα ίδια γονίδια-στόχους και μπορούν επίσης να ενεργοποιούν μεταγραφικά διαφορετικούς στόχους. Μια σειρά πρόσφατων μελετών τονίζουν φυσικές ιδιότητες, καθώς και συγκεκριμένες λειτουργικές περιοχές και τα αμινοξικά κατάλοιπα της καρβοξυτελικής ουράς των TAp73 ισομορφών που ενισχύουν ή εμποδίζουν την μεταγραφική δραστηριότητα και την αποπτωτική αποτελεσματικότητά τους. Αυτές οι α) το ηλεκτροστατικό φορτίο της καρβοξυτελικής περιοχής, β) οι περιοχές πλούσιες σε Pro και Glu/Pro, γ) το μοτίβο PPPPY και δ) η περιοχή SAM και η έσχατη καρβοξυτελική περιοχή (17).Η ογκογένεση περιλαμβάνει σαφώς καθορισμένα στάδια, μέσω των οποίων «επιτυχημένες» γενετικές αλλαγές προσφέρουν πλεονέκτημα ανάπτυξης σε φυσιολογικά κύτταρα, οδηγώντας τα στην προοδευτική μετατροπή τους σε καρκινικά κύτταρα. Το 2000, οι Hanahan και Weinberg ανέφεραν ορόσημα σε αυτή τη διαδικασία, δηλαδή τη διατήρηση πολλαπλασιαστικής σηματοδότησης, την καταστρατήγηση αναστολέων ανάπτυξης, την ενεργοποίηση της διείσδυσης και της μετάστασης, την απόκτηση ικανότητας αθανατοποιημένου διπλασιασμού, την επαγωγή της αγγειογέννεσης και την αντίσταση στον κυτταρικό θάνατο. Το 2011, οι ίδιοι επιστήμονες προσέθεσαν δύο ακόμη ορόσημα σε αυτή την σημαντική λίστα, δηλαδή τον επαναπρογραμματισμό του ενεργειακού μεταβολισμού και την καταστρατήγηση της καταστροφής από το ανοσοποιητικό σύστημα, καθώς και δύο νέα χαρακτηριστικά, δηλαδή την φλεγμονή που προάγει δημιουργία όγκου και τη γονιδιωματική αστάθεια. Είναι εντυπωσιακό ότι, οι ισομορφές TAp73 αναστέλλουν όλα αυτά τα ορόσημα και χαρακτηριστικά γνωρίσματα του καρκίνου, επηρεάζοντας δραστικά τις διαδικασίες που διέπουν την προώθηση του καρκίνου, την εξέλιξη και τη μετάσταση.Η ανακάλυψη των microRNAs (miRNAs) και της σχέσης τους με τον καρκίνο έχει ανοίξει μια νέα εποχή στη θεραπευτική προσέγγιση του καρκίνου. Τα miRNAs είναι μια ομάδα μικρών, μονόκλωνων στην ώριμη μορφή τους, μορίων RNAs μήκους 16-25 νουκλεοτίδια και συμμετέχουν στην αρνητική ρύθμιση πολλών γονιδίων. Πρότυπα έκφρασης των miRNAs θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για την ταξινόμηση, τη διάγνωση, τη θεραπευτική αγωγή, και την πρόγνωση των διαφορετικών τύπων του καρκίνου του ανθρώπου. Χρήση των μιμητικών μορίων miRNA και ανταγωνιστών των miRNA είναι οι δύο κύριες προσεγγίσεις για θεραπεία του καρκίνου με βάση τα miRNAs. Ο σκοπός της συγκεκριμένης διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη της λειτουργικής διάκρισης των ισομορφών TAp73 του γονιδίου p73 κατά την ογκογένεση. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτός ο στόχος μελετήθηκαν οι ισομορφές TAp73α, TAp73β και TAp73γ ως προς: τις διαφορές στις λειτουργικές περιοχές και τα λειτουργικά κατάλοιπα που περιλαμβάνει η κάθε μία ισομορφή, το μεταγραφικό πρότυπο έκφρασης των miRNAs που επάγουν και την ικανότητά τους, καθώς και οι μηχανισμοί που εμπλέκονται, να αναστέλλουν ορισμένα ορόσημα του καρκίνου όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ) και η κυτταρική κινητικότητα και διείσδυση. Έχει εκτενώς αναφερθεί στην βιβλιογραφία ότι τα δυο άλλα μέλη της οικογένειας του p53 επάγουν ορισμένα miRNAs, τα οποία με τη σειρά τους αναστέλλουν γονίδια σχετιζόμενα με το ΕΜΤ. Ο σκοπός της μελέτης ήταν να εντοπίσουμε, να ταυτοποιήσουμε και να χαρακτηρίσουμε αντίστοιχα miRNAs για το τρίτο μέλος της οικογένειας, το p73.Κάνοντας χρήση της δοκιμασίας επούλωσης πληγής και της ανοσοστύπωσης κατά Western, παρατηρήσαμε ότι οι ισομορφές TAp73 αναστέλλουν διαφορικά την μετανάστευση των κυττάρων in vitro και ρυθμίζουν αρνητικά πρωτεϊνικούς δείκτες σχετιζόμενους με την ΕΜΤ, όπως η zeb1, snail και η βιμεντίνη. Προκειμένου να ελεγχθεί αν αυτή η επίδραση είναι miRNA διαμεσολαβούμενη, αναζητήσαμε miRNAs που υπερεκφράζονται άμεσα μετά από επαγωγή των ισομορφών TAp73 κάνοντας χρήση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχειών των miRNAs. Αποκαλύψαμε ότι οι ισομορφές TAp73 ενεργοποιούν μεταγραφικά miRNAs τα οποία δυνητικά στοχεύουν παράγοντες σχετιζόμενους με την ΕΜΤ, το ευρέως μελετημένο miR-34a-5p και το, έως τώρα, αχαρακτήριστο miR-3158-5p. Το miR-3158-5p περαιτέρω ταυτοποιήθηκε ως άμεσος στόχος των ισομορφών TAp73 κάνοντας χρήση της δοκιμασίας της ανοσοκατακρύμνισης χρωματίνης (ChIP assay) και της δοκιμασίας λουσιφεράσης. Επιπλέον, ρυθμίζει αρνητικά την βιμεντίνη, έναν σημαντικό δείκτη της ΕΜΤ, και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου, τη μετανάστευση και διεισδυτικότητα in vitro. Το miR-3158-5p είναι υπό-εκφρασμένο σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού με υψηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού και διείσδυσης σε σύγκριση με καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού με χαμηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού και διείσδυσης. Κατασκευάστηκαν σταθερά διαμολυμένοι κλώνοι των κυτταρικών σειρών MDA-MB-231 και MDA-MB-468 οι οποίοι εξέφραζαν σταθερά το γονίδιο του MIR3158. Αυτές οι κυτταρικές σειρές του καρκίνου του μαστού είναι ιδιαίτερα διεισδυτικές. Σε όλους τους κλώνους και των δυο κυτταρικών σειρών που εξέφραζαν το MIR3158 παρατηρήσαμε πτώση στην ικανότητα πολλαπλασιασμού και την ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κλώνων, συγκριτικά με τους αντίστοιχους αρνητικούς μάρτυρες. Ομοίως, σε in vivo πειράματα παρατηρήθηκε η αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση του γονιδίου MIR3158 σε όλους τους κλώνους και των δυο κυτταρικών σειρών, μετά από 11 βδομάδες που διήρκησε η πειραματική διαδικασία. Επιπλέον, κάνοντας χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής, καταφέραμε να προσδιορίσουμε και να χαρακτηρίσουμε το ομόλογο γονίδιο MIR3158 στο ποντίκι. Ονομάσαμε το γονίδιο αυτό MIR3158Like, το οποίο και κλωνοποιήσαμε σε έναν φορέα έκφρασης και διαμολύναμε κύτταρα καρκινικής σειράς Α5 του ποντικού. Καταφέραμε να προσδιορίσουμε δύο νέα ώριμης μορφής miRNAs στο ποντίκι, δηλαδή mmu-miR-3158L-1 και mmu -miR-3158L-2. Τέλος, με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής καταφέραμε να προβλέψουμε ότι αυτά τα ώριμα miRNAs του ποντικού στοχεύουν άμεσα το mRNA της βιμεντίνης ποντικιού και δείξαμε ότι τα επίπεδα έκφρασης της βιμεντίνης του ποντικού μειώθηκαν μετά την έκφραση του νέου γονιδίου MIR3158Like του ποντικού.