Functional, structural and genetic studies on human glutamate dehydrogenases

Ιστορικό: Η αφυδρογονάση του γλουταμικού (GDH) είναι ένα άφθονο μιτοχονδριακό ένζυμο που καταλύει την αλληλομετατροπή του γλουταμικού σε α-κετογλουταρικό. Οι άνθρωποι διαθέτουν δύο λειτουργικά γονίδια τα οποία κωδικοποιούν για GDH, το απανταχού εκφραζόμενο GLUD1 (κωδικοποίηση για hGDH1) και το ιστο-ειδικό GLUD2 (κωδικοποίηση για hGDH2). Τα δύο ισο-ένζυμα, αν και μοιράζονται όλα, πλην 15 από τα 505 αμινοξέα τους στην ώριμη μορφή τους, διαφέρουν σημαντικά στις ιδιότητες ρύθμισής τους. Η hGDH2 ανιχνεύεται κυρίως στον εγκέφαλο, στο νεφρό και στους όρχεις, όπου συνεντοπίζεται με τη hGDH1 στη μιτοχονδριακή μήτρα. Και τα δύο ισο-ένζυμα λειτουργούν σχηματίζοντας ομο-εξαμερών, αλλά είναι προς το παρόν άγνωστο κατά πόσον μπορούν να σχηματίσουν και λειτουργικά ετερο-εξαμερή στις περιοχές όπου συν-εντοπίζονται. Εκτός από το φυσιολογικό ρόλο των ενζύμων στο μεταβολισμό, γενετικές μεταβολές στα γονίδια GLUD1 και GLUD2 έχουν συσχετιστεί με παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Συγκεκριμένα, οι μεταλλάξεις του γονιδίου GLUD1 οδηγούν στο σύνδρομο υπερινσουλινισμό / υπεραμμωνιαιμία, ενώ ένας πολυμορφισμός στο GLUD2 έχει συσχετισθεί με μικρότερη ηλικίας έναρξης της νόσου του Parkinson. Επιπλέον, υπάρχουν ενδείξεις ότι η hGDH παίζει κάποιο ρόλο στον νευροεκφυλισμό που σχετίζεται νόσο του Alzheimer (καθώς υπερέκφραση του αντίστοιχου γονιδίου οδηγεί σε σχετιζόμενες με το γήρας εκφυλιστικές μεταβολές στον ιππόκαμπο ποντικού), αν και απόδειξη για αυτό σε ανθρώπους ασθενείς που πάσχουν από άνοια δεν υπάρχει μέχρι σήμερα.Στόχοι: Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η περαιτέρω ανάλυση των ιδιοτήτων των ενζύμων hGDH1 και hGDH2 χρησιμοποιώντας λειτουργικές, δομικές, καθώς και γενετικές μεθόδους. Συγκεκριμένα, ερευνήσαμε αν τα ένζυμα hGDH1 και hGDH2 είναι ικανά να σχηματίζουν ετερο-εξαμερή όταν συνεκφράζονται, και τι συγκεκριμένες ιδιότητες μπορεί να διαθέτουν αυτά τα μακρομόρια. Ένας δεύτερος στόχος ήταν να επιτύχουμε και να αναλύσουμε τη μέχρι σήμερα άλυτη κρυσταλλική δομή της hGDH2, η οποία θα μας επιτρέψει να πραγματοποιήσουμε μια έγκυρη και ακριβή σύγκριση με την hGDH1 (η δομή της οποίας είναι ήδη γνωστή). Τέλος, αναλύσαμε το φάσμα των γενετικών παραλλαγών των γονιδίων GLUD1 και GLUD2 γονιδίων στο καλά χαρακτηρισμένο Κρητικό Δείγμα Ηλικιωμένων 201 ατόμων, που αποτελείται από ασθενείς που πάσχουν από άνοια και ήπια γνωστική εξασθένηση (MCI), καθώς και από γνωστικά φυσιολογικά άτομα.Μέθοδοι: Για να επιτευχθεί το πρώτο μέρος των στόχων μας, έχουμε δημιουργήσει hGDH ετερο-εξαμερή συμπλέγματα σε κύτταρα Sf21, χρησιμοποιώντας το σύστημα έκφρασης του βακουλοϊού. Πραγματοποιήσαμε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης και χρωματογραφίας συγγένειας για να διακρίνουμε μεταξύ των in vitro μιγμάτων χωριστά εκφρασμένων hGDHs και των in vivo 1:1 συν-εκφρασμένων hGDHs. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε μια σειρά κινητικών δοκιμασιών για να χαρακτηρίσουμε τις ιδιότητες των πιθανών ετερο-εξαμερών. Για το δεύτερο μέρος των στόχων μας, παράχθηκε το ένζυμο hGDH2 σε Sf21 καλλιέργειες μεγάλης κλίμακας και κατόπιν καθαρίστηκε σε ομοιογένεια, πριν επιτευχθεί η κρυστάλλωσή του μέσω επαναλαμβανόμενων δοκιμών, χρησιμοποιώντας διαφορετικές μεθόδους και αντιδραστήρια. Για τις γενετικές μελέτες, αξιοποιήσαμε τα δεδομένα που προέκυψαν από την αλληλουχία ολόκληρου του εξώματος σε 201 άτομα του Κρητικού Δείγματος Ηλικιωμένων ατόμων, από τα οποία 100 έπασχαν από άνοια, 20 είχαν ταξινομηθεί ως MCI και 81 ήταν γνωστκά φυσιολογικοί μάρτυρες. Μετά τον χαρακτηρισμό του γενετικού υπόβαθρου που σχετίζονται με την άνοια, επικεντρωθήκαμε στις παραλλαγές των γονιδίων GLUD1 και GLUD2.Αποτελέσματα: Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι οι hGDHs μπορούν να σχηματίσουν, εκτός από ομο-εξαμερή, ετερο-εξαμερή σύμπλοκα, όταν συν-εκφράζονται. Αυτά ετερο-εξαμερή ένζυμα διαθέτουν μοναδικές ενζυμικές ιδιότητες, οι οποίες κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες (απουσία ADP, L-λευκίνη ενεργοποίηση, θερμική σταθερότητα) είναι ενδιάμεσες μεταξύ των ιδιοτήτων του καθαρού hGDH1 και hGDH2 (και συνεπώς συγκρίσιμα με το 1:1 in vitro μίγμα των δύο ομο-εξαμερών μορφών), ενώ τείνουν να μοιάζουν με τη συμπεριφορά της hGDH2 σε σχέση με την αναστολή από GTP και από DES. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, επιτύχαμε για πρώτη φορά την παραγωγή υψηλής ποιότητας κρυστάλλων hGDH2 των 3.2Å για το χαρακτηρισμό της δομής της. Στο τρίτο μέρος της μελέτης (γενετική ανάλυση των GLUD1 και GLUD2 γονιδίων), βρήκαμε ότι η παραλλαγή Ser498Ala του GLUD2 εμφανίζεται συχνότερα σε φυσιολογικούς μάρτυρες (16,05%, n = 81) από ό,τι σε ασθενείς με άνοια (3,0%, n = 100? p = 0,003), και τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν με τη συμπερίληψη μιας επιπλέον τοπικής ομάδας ηλικιωμένων ατόμων στις αναλύσεις μας.Συμπέρασμα: Η μελέτη μας εγείρει την πιθανότητα ότι οι hGDH1 και hGDH2 σχηματίζουν ετερο-εξαμερή στα κύτταρα όπου συνεκφράζονται. Δεδομένου ότι οι λειτουργικές ιδιότητες αυτών των συμπλόκων είναι διακριτές από εκείνες των ομο-εξαμερών, η αλληλεπίδραση αυτή ενδέχεται να παρέχει ευελιξία στα ανθρώπινα κύτταρα, εξοπλίζοντας τα με περισσότερα από δύο ισο-ένζυμα. Οι δομικές μελέτες της hGDH2 αναμένεται, όχι μόνο να εξερευνήσουν τις ιδιαιτερότητές του, αλλά και να αποκρυπτογραφήσει τη δομική βάση των ενζυμικών διαφορών του από το υψηλά ομόλογο της ισο-ένζυμο hGDH1. Τέλος, στην πολιτισμικά και γενετικά ομοιογενή ομάδα της των ηλικιωμένων ατόμων του νησιού της Κρήτης, βρήκαμε ότι η παραλλαγή Ser498Ala του GLUD2 σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο για άνοια στον πληθυσμό μας.