Mechanisms of Tolerance to the Anticonvulsant Effects of Acetazolamide in Mice: Relation to the Activity and Amount of Carbonic Anhydrase in Brain

Summary: The mechanism by which tolerance develops to the anticonvulsant effects of acetazolamide (AZM) was investigated in Swiss‐Webster mice. The effects of single and six daily doses of 40 mg or 200 mg/kg AZM on elec‐troshock seizure threshold (EST), maximal electroshock (MES) seizure pattern, and on the activity and total amount of carbonic anhydrase II (CAII) in various subcellular fractions (cytosol, microsomes, and myelin) of cerebral cortex, cerebellum, and brainstem were assessed. The activity of CAII was measured by microas‐say, and the total amount was measured by immunoassay methods developed in this laboratory. From the activity (units per microgram of protein) and total amount (nanograms per microgram protein) data, the specific activity (units per nanogram CAII) of the enzyme was calculated. With multiple doses, tolerance developed to both elevation of the EST and modification of the MES pattern noted with single doses of AZM. Accompanying the development of tolerance to the anticonvulsant effects of AZM was an increase in both the activity and specific activity of CAII in the various subcellular fractions and areas of the brain. The effects were dose dependent. Tolerance to the EST‐elevating effects of AZM correlated with increases in the activity, total amount, and specific activity of CAII in the myelin fraction of the cerebral cortex. Tolerance to the anti‐MES effect correlated with increases in the activity, total amount, and specific activity of CAII in the cytosolic fraction of the brainstem. Development of tolerance to AZM proceeds by two mechanisms that are dose‐dependent: (a) increase in the total amount of enzyme, changes that suggest increased synthesis of CAII; and (b) activation of existing molecules of CAII, a process that appears to involve phosphorylation. The data suggest that the activity of CAII is regulated by several mechanisms in brain tissues and that preservation of its activity is vital to the normal functioning of the brain. RÉSUMÉ Les mécanismes de la tolérance aux effets anticonvulsants de acétazolamide (AZM) ont étéétudié sur des souris Swiss‐Webster. Les auteurs ont étudié les effets de doses uniques ou répétées 6 fois par jour de 40 ou de 200 mg/kg AZM sur le seuil critique àéiectrochoc (SCE), sur le déroulement des crises àéiectrochoc maximal (CEM) et sur activité et la quantité totale anhydrase carbonique II (ACI)au niveau de différentes fractions subcellulaires (cytosol, microsomes et myéline) du cortex cérébral, du cervelet et du tronc cérébral. activité de ACII a été mesurée par microdosage et sa quantité totale par une méthode radioimmunologique mise au point dans le laboratoire. A partir de activité (unités/μg de protéines) et de la quantité totale (ng/μg de protéines), activité spécifique de I'enzyme (unités/ng de ACII) a pu être calculée. Avec les doses multiples, une tolérance se développa à la fois envers élévation du SCE et la modification des CEM notées avec les doses uniques AZM. Parallèlement à installation une tolérance aux effets anticon‐vulsivants de AZM se produisit une augmentation de activité et de activité spécifique en ACII dans les différentes fractions subcellulaires et les différentes régions du cerveau. Les effets ont été dose‐dépendants. La tolérance aux effets élévateurs du SCE de AZM était corrélée aux augmentations activité, de quantité totale et activité spécifique de ACII dans la fraction myélinique du cortex cérébral. La tolérance a effet anti‐CEM de AZM ètait corrélée aux augmentations activité, de quantité totale et activité spécifique de ACII dans les fractions cytosoliques du tronc cérébral. installation une tolérance à AZM repose sur 2 mécanismes qui sont dose‐dépendants: (1) 1'augmentation de la quantité totale de enzyme, ce qui suggère une augmentation de synthèse de ACII, et (2) activation des molécules existantes ACII, processus qui semble impliquer une phosphorylation. Ces résultats suggerent que activite de ACII est reguiee par plusieurs mécanismes au sein des tissus cérébraux et que la préservation de son activité est vitale pour le fonctionnement normal du cerveau. RESUMEN En ratones Swiss‐Webster se han estudiado los mecanismos que conducen a la tolerancia de los efectos anticonvulsivos de la acetozolamida (AZM). Se han determinado los efectos de una dosis única y también los de 6 dosis diarias de 40 mg o 200 mg/kg de AZM sobre el umbral de ataques por electroshock (EST), sobre el partón de los ataques después de electroshock máximo (MES) y sobre la actividad y la cantidad total de la carbónico‐anhydrasa II (CAII) en varias fracciones subcelularese (citosol, microsomás y mielina) de la corteza cerebral, cerebelo y tronco cerebral. La actividad de la CAII fue medida mediante microen‐sayos y la cantidad total mediante metodos de inmunoensayos desarrollados en este laboratorio. Se calculó la actividad espe‐cifica de esta encima (unidades/ng CAII) según la actividad (unidades/ug proteina) y la cantidad total (ng/ug proteinas). Con múltiples dosis, se observó tolerancia a la elevación de las EST y a la modificacidn del partón de los MES que se había con‐seguido con dosis única de AZM. Acompañando al desarrollo de la tolerancia a los efectos anticonvulsivos de la AZM, se observó un incremento de la actividad y de la actividad específica de la CAII en las diversas fracciones subcelulares y áreas cerebrales. Los efectos fueron dosis‐dependiente. La tolerancia a la ele‐vacidn de los efectos de los EST de la AZM correlacionaban bien con el incremento de la actividad, de la cantidad total y de la actividad específica de la CAII en las fracciones de mielina del cortex cerebral. La tolerancia a los efectos anti‐MES correlacionaban bien con los incrementos de la velocidad, de la cantidad total y de la actividad especifica de la CAII en las fracciones del citosol del tronco cerebral. El desarrollo de tolerancia a la AZM sigue a dos mecanismos que son dosis‐dependiente: (1) incremento en la cantidad total de la encima, cambios que sugieren un incremento de la síntesis de la CAII, y (2) activación de las moieculas de CAII previamente existentes, un proceso que parece debido a la fosforilización. Toda esta información sugiere que la actividad de la CAII está regulada por varios mecanismos en los tejidos cerebrales y que la preservación de esta actividad es vital para el funcionamiento normal del cerebro. ZUSAMMENFASSUNG Mechanismen der Toleranzentwicklung auf die antikonvulsive Wirkung von Acetazolamid (AZM) wurde bei Swiss‐Webster Mäusen untersucht. Hierzu wurde die Wirkung einer einzelnen sowie von 6 täglichen Gaben von 40, bzw. 200 mg/kg AZM auf die Elektroschockkrampfschwelle (EST), das Anfallsmuster unter maximalem Elektroschock (MES) sowie auf Aktivität und Absolutbetrag von Carboanhydrase II (CAII) in verschiedenen subzellulären Fraktionen (Cytosol, Microsomen und Myelin) des zerebralen Kortex, des Cerebellums und Hirnstamms bestimmt. Die CAII‐Aktivität wurde mit Hilfe eines Mikroassays gemes‐sen, der Absolutbetrag mit einem Immunoassay, der im eigenen Labor entwickelt wurde. Aus der Aktivität (Einheiten/ug Protein und dem Absolutbetrag (ng/ug Protein) wurde die spezifische Aktivitat (Einheiten/ng CAII) des Enzyms berechnet. Mit wie‐derholten AZM‐Gaben entwickelte sich eine Toleranz sowohl hinsichtlich der Erhöhung der EST als auch einer Modifizierung des MES‐Anfallsmusters, wie sie bei Einzeldosen gesehen wur‐den. Mit der Toleranzentwicklung gegenüber der antikonvul‐siven Wirkung von AZM zeigte sich eine Erhöhung sowohl der Aktivität als auch spezifischen Aktivität von CAII in den verschiedenen subzellulären Fraktionen und Hirngegenden. Disese Wirkungen waren Dosisabhängig. Die Toleranz gegenüber den EST‐erhöhenden Effekt von AZM korrelierte mit der Aktivität‐serhöhung, dem Absolutbetrag und der spezifischen Aktivität von CAII in der Myelinfraktion des zerebralen Korte Die Tole‐ranzerhohung gegenüber der Anti‐MES‐Wirkung korrelierte mit Erhöhung der Aktivität, dem Absolutbetrag und der spezifischen Aktivität von CAII in der Cytosolfraktion des Hirnstammes. Die Toleranzentwicklung gegenüber AZM geht mit 2 dosisabhän‐gigen Mechanismen einher 1. Erhöhung im Absolutbetrag des Enzyms, was auf eine erhöhte CAII‐Synthese deutet und 2. Ak‐tivierung von bereits existierenden CAII‐Molekule ein Prozess, der eine Phosphorylierung mit zu beinhalten scheint. Die Ergeb‐nisse legen nahe, daß die CAII‐Aktivität durch verschiedene Mechanismen im Hirngewebe gesteuert wird und daß ihre Er‐haltung für die normale Hirnfunktion von vitaler Bedeutung ist.