Free Fraction of Valproic Acid: In Vitro Time‐Dependent Increase and Correlation with Free Fatty Acid Concentration in Human Plasma and Serum

Summary: The effect of sample incubation and storage on the protein binding of the antiepileptic drug valproic acid (VPA) and on the concentration of free fatty acids (FFA) was investigated in serum and plasma collected from four normal volunteers. Both the free fraction of VPA and the concentration of FFA increased progressively with time when samples were incubated at 4 to 37 o C. These effects occurred to the same extent in both serum and heparinized plasma. At 4 o C and at room temperature, the increase in free drug fraction was relatively small (18 and 25% respectively at 24 h), whereas at 37 o C it was quite considerable (24% at 8 h and 40% at 24 h). At room temperature, FFA rose on average by 22% at 4 h, 34% at 8 h, and 86% at 24 h, whereas at 37 o C the increases at the same incubation times were 59, 90, and 160%, respectively. There was a strong positive relationship between changes in free VPA fraction and FFA content of the samples. The time‐dependent changes in VPA binding capacity described in this study may lead to overestimation of the actual free concentration in vivo, especially when this is estimated by equilibrium dialysis or ultracentrifugation techniques requiring long incubation (centrifugation) times at 37 o C. RÉSUMÉ L'effet de L';incubation et de la conservation des prélèvements seriques et plasmatiques sur la fixation prot́eique de L';acide valproique (VPA) et sur la concentration des acides gras libres (FFA) a étéétudié chez quatre volontaires sains. La fraction libre de VPA et la concentration des FFA s'élèvent progressivement en fonction du temps lorsque les prélèvements sont incubés entre 4 et 37 o C. On observe les mêmes effets pour le serum et le plasma hépariné. A 4 o C et à la température ambiante L';augmentation de la fraction libre de médicament est relativement faible (respectivement 18% et 25%à 24 heures), alors qu'à 37 o C elle est nettement plus importante (24%à 8 heures et 40%à 24 heures). A la température ambiante les taux de FFA s'élèvent environ de 22%à 4 heures, 34%à 8 heures et 86%; à 24 heures, tandis qu'à 37 o C les augmentations au même temps D'incubation sont respectivement de 59%, 90% et 160%. On observe une importante correlation positive entre les modifications de la fraction libre de VPA et les taux de FFA libres. Les modifications en fonction du temps du degré de fixation du VPA décrites dans ce travail conduisent à surestimer la concentration réelle de la forme libre de la drogue in vivo, particulièrement lorsqu'elle est évaluée par dialyse à L';équilibre ou ultrafiltration, techniques demandant de longs temps D'incubation (centrifugation) à 37 o C. RESUMEN En el suero y plasma de cuatro voluntarios normales se han investigado los efectos de la incubación y al‐macenamiento de las muestras sobre el acoplamiento (ligadura) proteico del ácido valproico (VPA) y sobre la concentración de ácidos grasos libres (FFA). Ambos datos, la fracción libre del VPA y la concentración de los FFA aumentaron progresivamente en el tiempo cuando las muestras se incubaron de 4 a 37 o C. Estos efectos ocurrieron con la misma intensidad en el suero y en el plasma heparinizado. A 4 o C y a la temperatura ambiente el incremento de la fracción libre de droga fue relativamente pequeño (18 y 25% respectivamente a las 24 horas) mientras que a 37 o C fué considerable (24% a las 8 horas y 40% a las 24 horas). A temperatura ambiente, los FFA aumentaron en un promedio de 22% a las 4 horas, 34% a las 8 horas y 86% a las 24 horas mientras que a 37 o C los incrementos, con los mismos tiempos de incubación, fueron de 59%, 90%'y 160% respectivamente. Se observó una fuerte relación positiva entre los cambios de la fracción libre del VPA y el contenido de los FFA de las muestras. Los cambios de la capacidad de ligadura del VPA, dependientes del tiempo, descritos en este estudio pueden conducir a una superestimación de la real concentración libre in vivo, especialmente cuando se estima mediante técnicas de diálisis de equilibrio o ultracentrifugación que requieren prolongados tiempos de incubación (centrifugación) a 37 o C. ZUSAMMENFASSUNG Die Wirkung der Inkubation und der Aufbewahrung einer Blutprobe auf die Eiweißbindung des An‐tiepileptikums VPA und auf die Konzentration der freien Fettsäuren wurde im Serum und Plasma von 4 normalen Freiwilligen bestimmt. Sowohl die freie Fraktion von VPA als die Konzentration der freien Fettsäuren (FFA) nahmen allmählich mit der Zeit zu, wenn die Proben zwischen 4 und 37 Grad C. inkubiert wurden. Diese Effekte waren in gleichem Ausmaß sowohl im Serum wie im heparinisierten Plasma zu beobachten. Bei 4 o C und bei Zimmertemperatur war die Zunahme der freien Medikamentenfraktionen relativ gering (18 bzw. 25% bei 24 Stunden). Während sie bei 37 o C beträchtlich war (24% bei 8 und 40% bei 24 Stunden). Bei Zimmertemperatur stiegen die FFA im Durchschnitt um 22% nach 4 Stunden, urn 34% nach 8 Stunden, um 86% bei 24 Stunden, während die Zunahme bei 37 o C und der gleichen Inkubationszeit 59%, 90% bzw. 160% betrugen. Es bestand eine starke positive Beziehung zwischen den Veränderungen der Fraktion des freien VPA und dem FFA‐Gehalt der Proben. Die zeitabhangigen Veränderungen der Bindungs‐kapazität des VPA, die in dieser Untersuchung beschrieben wurden, könnten besonders dann einer Überschatzung der aktuellen freien Konzentration in vivo Anlass geben, wenn diese Konzentration durch Methoden der Equilibrium‐Dialyse oder die Technik der Ultrazentrifugierung bestimmt wurden, die lange lnkubations‐(Zentrifugierungs‐) Zeiten bei 37 o C benötigen.