Changes in the Number, Size, and Shape of Synaptic Vesicles in an Experimental, Projected Cortical Epileptic Focus in the Rat

Summary: A projected epileptic focus was induced in the brains of experimental rats by applying penicillin G sodium to the contralateral hemisphere. Synapses of type I (after Gray) in the second cortical layer of the mirror area were analyzed morphometrically in the electron microscope 30 min after application of the epileptogenic drug. The number of agranular synaptic vesicles was counted per 0.01 μm 2 over the active zone of the presynaptic membrane in an area 0.1 μm wide adjacent to the active zone and in an area of the same width 0.1 μm distant from the active zone. A statistically significant increase in the number of synaptic vesicles was found in the experimental animals as compared with the controls. The number of synaptic vesicles per 0.01 μm 2 area was evaluated along the inactive presynaptic membrane, both in the area adjacent to the active zone of the presynaptic membrane and in other areas at successively greater distances from the active zone. The counts in some of these latter areas were statistically significantly higher in the experimental animals. The size and shape of synaptic vesicles were evaluated in three zones, each 0.1 μm wide, parallel to the membrane of the synaptic cleft. Zone I was directly adjacent to the membrane of the synaptic cleft; zone II was 0.1 μm distant; and zone III 0.2 μm distant from the membrane. The results show that the synaptic vesicles of both the experimental and control animals are significantly smaller in zone I than in the more distant zones. This trend is more marked in the controls than in the experimental animals. Histograms of vesical areas of zones II and III in the controls point to two populations of vesicles. The volumes of vesicles are approximately 10% greater in zone I of experimental animals than in the controls. The elongation of the vesicles in the three zones does not differ statistically either in controls or in experimental animals. Experimental animals, however, have statistically more rounded vesicles than the controls. Assuming that the synaptic vesicles contain the transmitters, our results might contribute to a better understanding of the increased excitability of the epileptic focus area. RÉSUMÉ Des foyers épileptiques expérimentaux cérébraux projetés ont été provoqués chez le rat par application sur l'hémisphère contralatéral de Na‐G‐penicilline. Les synapses de type 1 (selon Gray) de la seconde couche corticate de la région en mirroir ont été analysées morphométriquement au microscope électronique 30 min après application de la substance épileptogène. Le nombre de vésicules synaptiques agranulaires a été compte par 0.01 μm 2 de membrane présynatique, au niveau de la zone active, sur une portion d'une largeur de 0.1 μm adjacente à la zone active (valeur A, Fig. 2) et sur une portion de même largeur distante de 0.1 μm de cette zone active (valeur B, Fig. 2). Une augmentation stastitiquement ségnificative (p < 0.001) du nombre des vésicules synaptiques a été trouvée chez les animaux d'expérience par rapport aux animaux de contrôle: au niveau de A de 12.6%, au niveau de B de 19.5%, au niveau de (A + B)/2 de 15.6%. Le nombre de vésicules synaptiques par 0.1 times 0.1 μm a étéévalué le long de la membrane présynaptique, au niveau de la zone inactive en partant d'un carré de membrane présynaptique prélevé dans la région adjacente à la zone active, puis au niveau d'au‐tres provenant de zones de plus en plus distantes de cette zone active (valeurs C, D, E, F, G, Fig. 2). Chez les animaux d'expérience les valeurs de D, E, F, G sont plus élevées et de façon statiquement significative de 34.9%, 31.8%, 93.5%, 57.8%. La taille et la forme des vésicules synatiques ont étéévaluées dans 3 zones, chacune de 0.1 μm de largeur, parallèlement à la membrane de l'espace synaptique. La zone I était directement adjacente à la membrane de I'espace synaptique, la zone II était distante de 0.1 μm de cette membrane et la zone II de 0.2 μm (Fig. 5). Les résultats montrent que les vésicules synaptiques des animaux d'expérience et de ceux de contrôle sont plus petites dans la zone I que dans les zones plus distantes. Cette augmentation progressive de la taille des vésicules est plus marquée chez les animaux de contrôl que chez ceux d'expérience. Les histogrammes de la tailles des vésicules chez les animaux de contrôle ont mis en évidence deux populations de celles‐ci dans les zones II et III. Le volume des vésicules est ap‐proximativement 10% plus grand dans la zone I chez les animaux d'expérience que chez ceux de contrôle. L'élongation des vésicules dans les trois zones n'est pas statistiquement différente qu'il s'agisse des animaux de contrôle ou d'expérience. Les animaux d'expérience ont cependant statistiquement plus de vésicules arrondies que ceux de contrôle. Si Ton présume que les vésicules synaptiques contiennent des transmetteurs, nos résultats peuvent contribuer à une meilleure compréhension de (augmentation de I'ex‐citabilité de la région où se trouve le foyer épileptique projeté. ZUSAMMENFASSUNG Ein projezierter epileptischer Fokus wurde in dem Gehirn von Ratten dadurch erzielt, daß Natrium‐G‐Penicillin auf die kontralaterale Hemisphäre appliziert wurde. Synapsen des Typs I (nach Gray) in der 2. kortikalen Schicht der Spiegelgegend wurden morphometrisch, elektronenmikroskopisch 30 Minu‐ten nach Applikation des epileptogenen Medikaments analysiert. Die Anzahl der nicht granulären synaptisch‐en Vesikel wurde je 0.01 μm2 über der aktiven Zone der präsynaptischen Membran in einerO. 1 μm weiten, anschließend an die aktive Zone (Wert A, Abb. 2) und in einer Zone derselben Weite mit 0.1 μm Abstand von der aktiven Zone (Wert B, Abb. 2) bestimmt. Ein statistisch signifikanter Anstieg (p < 0.001) in der Anzahl der synaptischen Vesikel wurde bei den Ver‐suchstieren verglichen mit den Kontrollen gefunden: Bei A urn 12.6%, bei B urn 19.5%, bei (A + B)/2 urn 15.6%. Die Anzahl der synaptischen Vesikel je 0.1 mal 0.1 μm wurde entlang der inaktiven präsynaptischen Membran bestimmt. Sowohl im Quadrat benachbart zur aktiven Zone der präsynaptischen Membran als auch in weiteren Quadraten in entsprechendem Abstand von der aktiven Zone (Werte C, D, E, F, G, Abb. 2). Die Werte D, E, F, G sind beim Versuchstier statistisch signifikant höher urn 34.9%, 31.8%, 93.5%, 57.8%. Die Größe und Form der synaptischen Vesikel wurden in 3 Zonen ausgewertet jede war 0.1 μm weit. Sie liefen parallel der Membran des synaptischen Spalts. Zone I schloß sich direkt an die Membran der synaptischen Spalte an, Zone II um 0.1 μm entfernt, Zone III 0.2 μm von der Membran entfernt, (Abb. 5). Die Ergebnisse zeigen, daß die synaptischen Vesikel sowohl der experimentellen als auch der Kontrolltiere signifikant kleiner in der Zone I als in weiter entfernten Zonen sind. Dieser zunehmende Trend ist deutlicher bei Kontrollen als bei den Tieren des Experiments. Histogramme der Bläschenareale der Zone II und III bei Kontrollen deuten auf 2 Populationen von Vesi‐keln. Die Volumina der Vesikel sind annähernd 10% größer in der Zone I bei den Tieren des Experiments als bei den Kontrollen. Die Elongation der Vesikel in den 3 Zonen unterscheidet sich statistisch weder bei Kontrollen noch bei den Tieren des Experiments. Die Tiere des Experiments haben jedoch statistisch eher runde Vesikel als die Kontrollen. In der Annahme, daß die synaptischen Vesikel Transmitter enthalten, könnten unsere Ergebnisse zu einem besseren Ver‐ständnis der vermehrten Excitabilität der Gegend des epileptischen Fokus beitragen. RESUMEN Se indujo un foco epiléptico proyectado en el cere‐bro de ratas de experimentación aplicando penicilina G sódica en el hemisferio contralateral. Se analizaron morfométricamente las sinapsas tipo I (según la clasificación de Gray) de la segunda capa cortical del área “en espejo” por medio de un microscopio elec‐trónico 30 min después de la aplicación del fármaco epileptogénico. Se contó el número de vesículas sinápticas agranulares por cada 0.01 μm2 en la zona activa de la membrana presináptica y en un espesor de 0.1 μm en esa misma región (valor A, Figura 2) y en una zona distante 0.1 μm de la región activa (valor B, Figura 2) en el mismo espesor. Se encontró un aumento esta‐dísticamente significativo (p < 0.001) en el número de vesiculas sinápticas en los animales de experimentación cuando se compararon con el grupo control: En A fue el 12.6%, en B fue del 19.5% y (A + B)/2 fue 15.6%. El número de vesículas sinápticas por 0.1 μm2 fue evaluado en la membrana presináptica inactiva, tanto en un cuadrado de esas dimensiones adyacente a la zona activa como en cuadrados sucesivamente dis‐tantes de esa región activa (valores C, D, E, F y G, Figura 2). Los valores D, E, F y G en los animales de experimentacion fueron significativamente más altos: 34.9%, 31.8%, 93.5% y 57.8% respectivamente. El taman̈o y la forma de la vesiculas sinápticas fueron evaluados en tres zonas, cada una de 0.1 μm de an‐chura y paralelas a la membrana de la hendidura sináptica. La zona I era adyacente de manera directa a la hendidura sináptica. La zona II estaba a 0.1 μm y la zona III distaba 0.2 μm de la membrana (Figura 5). Los resultados mostraron que las vesículas sinápticas, tanto de los animales de experimentación como de los controles, eran significativamente menores en la zona I que en zonas más alejadas. Sin embargo, esa tenden‐cia a aumentar era más notable en el grupo control que en los animales experimentales. Los histograms de las áreas vesicates de las zonas II y III del grupo control apuntaron a la existencia de dos poblaciones de vesiculas. El volumen de las vesiculas en la zona I de los animales experimentales era alrededor de un 10% mayor que en el grupo control. El alargamiento de las vesículas en las tres zonas no difería desde un punto de vista estadistico en los controles o en los animales de experimentación. Sin embargo, el número de vesiculas redondeadas en los animales de experimentación sí era mayor que en el grupo control. Asumiendo que las vesículas sinápticas contengan neurotransmisores, nuestros resultados pudieran contribuir a un cono‐cimiento mejor del aumento de excitabilidad en la región del foco epileptico.