Valproic Acid Binding to Human Serum Albumin and Determination of Free Fraction in the Presence of Anticonvulsants and Free Fatty Acids

Summary: The interaction between valproic acid (VPA) and human serum albumin (HSA) was investigated using the equilibrium dialysis technique under various conditions. Solutions of VPA in HSA (2 × 10 ‐4 M) were dialyzed against isotonic phosphate buffer at 37 o C. Protein and buffer compartments were assayed for VPA by GLC. The free fraction (a) of VPA increased from 0.13 at 27 μg/ml to 0.49 at 103 μg/ml. Scatchard plots were linear, indicating the existenc'e of one type of binding site. The mean (±% SD) number of binding sites per macromolecule was 2.06 ± 3.7% and the mean (±% SD) association constant was 2.69 × 10 4 ± 15.0% liters/mole. The effects of three anticonvulsants (phenytoin, phenobarbital, and carbamazepine) and four major free fatty acids (FFA) (stearic, palmitic, oleic, and linoleic) on a were studied. The free fraction, 0.18, was not affected by phenobarbital (20 and 40 μg/ml ), carbamazepine (10 and 20 μg/ml) or phenytoin (20 and 40 μg/ml). Each of the four FFA caused a significant increase in a: 19–48% increase at 100 μ/ml of FFA and 88–118% at 200 μg/ml. RÉSUMÉ Ľinteraction entre Ľacide valproïque (VPA) et l'albumine sérique humaine (HSA) a étéétudtee en utilis‐ant une technique d'gquilibre de dialyse sous diverses conditions. Les solutions de VPA dans HSA (2 × 10 ‐4 M) sont mises á dialyser contre un tampon phosphate isotonique a 37 o C. La determination de VPA dans les compartiments proténe et tampon a été faite par GLC. La fraction libre (α) de VPA augmente de 0.13 pour 27 μg/ml 0.49 pour 103 μg/ml. Les courbes de Scatchard sont linéaires montrant l'existence d'un seul type de sites de liaison. Le nombre moyen (+% SD) des sites de liaison par macromotelcule etait de 2.06 ± 3,7% et la moyenne (±% SD) de la constante d'association était de2.69 × 10 4 ± 15.0% liters/mole. Les effets sur α de 3 anttépileptiques (phénytoine, phénobarbital, et carbamazépine) et des 4 principaux acides gras libres (FFA) (stéarique, palmitique, oléique, et linoléique) ont étéétudtes. La fraction libre, 0.18, n'était pas modifée par le phénobarbital (20 et 40 μg/ml), la carbamazdpine (10 et 20 μg/ml), ou la phénytoïne (20 et 40 μg/ml). Chacun des quatre FFA entraine une augmentation significative de a: 19–48% pour 100 μg/ml de FFA et 88–118% pour 200 μg/ml. RESUMEN Utilizando la técnica de diálisis en equilibrio, se ha investigado la interactión entre ácido valpróico (VPA) y albúmina sérica humana (HSA), bajo condiciones diversas. Soluciones de VPA en HSA (2 × 10 ‐4 M) fueron dializadas contra un buffer isotbnico de fosfato a 37 o C. Se calcularon los compartimientos de proteina y buffer para el VPA y GLC. La fraction libre (α) del VPA aumentb de 0.13 en 27 μg/ml a 0.49 en 103 μg/ml. Las diagramas de Scatchard eran lineares lo que indica la existencia de un tipo de lugar de unidn. El promedio (±% SD) del niimero de lugares de unidn por mac‐romoiecula fue de 2.06 × 3.7% y el promedio (±% SD) de la constante de asociacion fue de 2.69 × 10 4 ± 15.0% liters/Mole. Se han estudiado los efectos sobre α de tres anticonvulsivantes (fenitoina, fenobar‐bital, y carbamazepina) y de cuatro écidos grasos (FFA) (estearico, palmftico, oleico, y linoieico). La fracción libre, 0.18, no se modificó con el fenobarbital (200 a 400 μg/ml), la carbamazepina (10 a 20 μg/ml), o la fenitoina (20 a 40 μg/ml). Cada uno de los cuatro FFA produjo una elevacitin significativa en α: 19–48% de aumento en 100 μg/ml de FFA y 88–118% en 200 μg/ml. ZUSAMMENFASSUNG Die Interaktion zwischen Valproatsaure (VPA) und menschlichem Serumalbumin (HSA) wurde mit der Äquilibriumdialysetechnik unter verschiedenen Bedin‐gungen untersucht. Lösungen von VPA in HSA (2 × 10 ‐4 M) wurden gegen isotonischen Phosphatpuffer bei 37 Grad Celsius dialysiert. Eiweiß und Puffercompartments wurden für VPA mittels Gaschromatographie untersucht. Die freie Fraktion (a) des VPA stieg von 0.13 bei 27 Mikrogramm/ml auf 0.49 bei 103 Mikrogramm/ml. Scatchard plots verliefen linear und weisen auf das Vorhandensein eines Typs von Bin‐dungsstellen. Die mittlere Anzahl (±% SD) von Bin‐dungsstellen pro Makromolekiil betrug 2.06 × 3.7% und die mittlere Assoziationskonstante (±% SD) betrug 2.69 × 10 4 ± 15.0%liters/Mole. DieWirkungvon3 Antikonvulsiva (Phenytoin, Phenobarbital, und Car‐bamazepin) und 4 wesentlichen freien Fettsauren (FFA: Sterin, Palmetin, Olein, Linoleinsaure) auf α wurde untersucht. Die freie Fraktion, 0.18, wurde nicht verandert durch Phenobarbital (240 Mikrogramm/ml), Carbamazepin (10 und 20 Mikrogramm/ml), oder Phenytoin (20 und 40 Mikrogramm/ml). Jede der 4 FFA verursachte einen signifikanten Anstieg von a: 19–48% Anstieg bei 100 Mikrogramm/ml und 88–118% bei 200 Mikrogramm/ml FFA.