Expression of human blood clotting factor VIII (FVIII) constructs in the mammary gland of transgenic mice and sheep

Summary The aim of this study is to produce transgenic mice and sheep which express large amounts of human anti‐hemophilic factor VIII (FVIII) in the mammary gland. To overcome the potentially low expression of cDNA‐constructs we have added heterologous introns from the murine metallothionein (MT‐I) gene, resulting in gene constructs of 13 200 and 14 400 bp, respectively. Via microinjection of zygotes recovered from superovulated donors, we have produced 25 lines of transgenic mice with four different constructs of which two are under the control of the β‐lactoglobulin (β‐Lac) promoter and two under the control of the Whey acidic protein (WAP) promotor. One of the β‐Lac‐ or WAP‐hFVIII constructs possessed the MT‐I fragment containing both introns in the 3′‐untranslated region of the FVIII cDNA, respectively. Expression of FVIII cDNA was determined in mammary tissue of the transgenic mouse lines by reverse transcriptase PCR (RT‐PCR). Of these 25 transgenic lines 13 (52%) expressed the integrated gene construct (WAP hFVIII 7/4, WAP hFVIII MT‐I 11/5, β‐Lac hFVIII 2/1, β‐Lac hFVIII MT‐I 5/3). By restriction enzyme analysis of the PCR products and Southern Blot analysis with FVIII probes we confirmed specificity of the expression of the transgene. Following microinjection of β‐Lac hFVIII or β‐Lac hFVIII MT‐I constructs we have generated 8 transgenic founder sheep. One β‐Lac hFVIII MT‐I sheep expressed FVIII in the lactating mammary gland as detected by RT‐PCR from biopsied mammary gland tissue. Two male founder animals transmitted the transgene in a Mendelian fashion to their offspring. To achieve site independent expression, new gene constructs employing matrix‐attachment region elements (MAR) (MAR‐β‐Lac‐hFVIII MT‐I) were recently microinjected into pronuclei and two female and two male founder lambs were obtained. The total efficiency of microinjection into pronuclei of ovine zygotes has been 2.9% transgenic lambs (12/413). Analysis of mouse and sheep milk using two different clotting assays and a sandwich ELISA did not reliably indicate the presence of active FVIII in milk. Currently, identification of FVIII in the milk of transgenic founder and F 1 females with the aid of a sensitive antibody is under investigation. Zusammenfassung Expession von Genkonstruktion mit dem menschlichen Blutgerinnungsfaktor VIII in der Milchdrüse transgener Mäuse und Schafe Zielsetzung unserer Untersuchungen ist die Erstellung transgener Mäuse und Schafe, die größere Mengen an humanem Gerinnungsfaktor VIII (FVIII) in der Milchdrüse exprimieren. Um die potentiell niedrige Expression von cDNA‐Konstrukten zu überwinden, haben wir heterologe Introns vom Maus‐Metallothionein‐Gen (MT‐I Gen) hinzugefügt, was in Genkonstrukten von 13 200 bzw. 14 400 bp resultierte. Durch Mikroinjektion in Zygoten, die von superovulierten Spendertieren gewonnen waren, haben wir 25 transgene Mäuselinien mit vier verschiedenen FVIII‐Konstrukten erstellt. Von diesen Konstrukten waren jeweils zwei unter der Kontrolle des β‐Lactoglobulin‐Promotors (β‐Lac) und zwei unter der Kontrolle des Whey‐Acidic‐Protein (WAP) Promotorelements. Jeweils eines der β‐Lac und eines der WAP hFVIII‐Konstrukte besaß das MT‐I Fragment mit den beiden Introns in der 3‐untranslatierten Region der FVIII cDNA. Die Expression der FVIII cDNA im Milchdrüsengewebe der transgenen Mäuselinien wurde über Reverse Transkriptase‐PCR (RT‐PCR) bestimmt. Von den 25 transgenen Linien exprimierten 13 (52%) das integrierte Genkonstrukt (WAP‐hFVIII 7/4, WAP‐hFVIII Mt‐I 11/5, β‐Lac‐hFVIII 2/1, β‐Lac‐hFVIII MT‐I 5/3). Durch Restriktionsenzymanalyse der PCR‐Produkte und Southern Blot Analyse der FVIII‐Proben haben wir die Speziftät der Expression der Transgene bestätigt. Nach Mikroinjektion von β‐Lac‐hFVIII oder β‐Lac‐hFVll‐MT‐I Konstrukten haben wir auch 8 transgene Founderschafe erhalten. Ein β‐Lac‐hFVIII‐MT‐I Schaf exprimierte FVIII in der laktierenden Milchdrüse, was über RT‐PCR in biopsiertem Milchdrüsengewebe festgestellt wurde. Zwei männliche Foundertiere gaben das Transgen entsprechend der Mendelschen Regeln an die Nachkommen weiter. Um eine vom umliegenden Genom unabhängige Expression zu erreichen, haben wir neuartige Gen‐konstrukte mit Matrix Attachment Region Elements (MAR) (MAR‐β‐Lac‐hFVIII‐MT‐I) in die Vorkerne von Schafzygoten injiziert und zwei weibliche und zwei männliche Founderlämmer erhalten. Insgesamt betrug die Effizienz der Mikroinjektion 2,9% (12 von 413 Lämmern waren transgen). Die Analyse von Maus‐ und Schafmilch mit zwei verschiedenen Gerinnungsassays sowie einem Sandwich ELISA ergab keine zuverlässigen und wiederholbaren Hinweise auf die Anwesenheit von aktivem FVIII in der Milch. Zur Zeit wird die Milch mittels transgener Founder‐ und F 1 ‐Schafe mit Hilfe eines empfindlichen Antikörpers und Immunpräzipitation auf Anwesenheit des FVIII‐Proteins untersucht.