The Sperm Acrosome: Immunological Analysis using Specific Polyclonal and Monoclonal Antibodies Directed Against the Outer Acrosomal Membrane of Boar Spermatozoa

Summary:  An antiserum to the purified porcine outer acrosomal membrane (OAM) was raised in female Balb/c mice and was characterized by means of an indirect ELISA. The hyperimmune serum reacted selectively with the acrosomal cap of the sperm head and showed an extremely good cross reactivity with bull and human spermatozoa when assayed by indirect immunofluorescence. Immunoelectron microscopy using the protein A‐gold method further confirmed the specificity of the anti‐OAM‐antiserum for the OAM. In an effort to identify the OAM antigens recognized by the hyperimmune serum and to analyse the extent of cross reactivity on a molecular level, the SDS‐extractable proteins were separated by SDS‐PAGE, transblotted and immunoprinted using an 12S J‐con‐jugated anti‐mouse‐antibody. To facilitate functional and structural analysis of distinct OAM‐proteins monoclonal antibodies were generated by hybridization of mouse myeloma cells with the splenocytes of female Balb/c mice immunized with the purified OAM. One fusion resulted in about 100 anti‐OAM‐antibodies secreting hybridoma cultures, of which about 30% showed cross reaction with human and bull spermatozoa. Four stable cell lines were selected for this study secreting antibodies directed against the outer acrosomal membrane of boar spermatozoa. Whereas the polyclonal immune mouse serum stained the entire acrosomal cap, the four hybridoma antibodies generated a patch‐work‐like immunofluorescence pattern over the acrosome. HPLC‐ELISA of the solubilized OAM revealed first information on the nature of the corresponding membrane antigen. Zusammenfassung:  Gegen die gereinigte äußere akrosomale Membran (OAM) aus Eber‐spermatozoen wurde bei weiblichen Balb/c‐Mäusen ein Antiserum gewonnen und mittels indirekten ELISA charakterisiert. Das Anti‐OAM‐Serum reagiert in der indirekten Immun‐fluoreszenz ausschließlich mit der akrosomalen Kappe des Spermatozoenkopfes und weist eine außerordentlich gute Kreuzreaktivität mit menschlichen Spermatozoen und Spermatozoen vom Bullen auf. Durch Immunelektronenmikroskopie wurde mittels der Protein‐A‐Gold (pAg)‐Methode die Spezifität des Antiserums gegen die OAM belegt. Um das Ausmaß der Kreuzreaktivität auf molekularer Ebene feststellen zu können, wurden die SDS‐extrahierbaren Spermatozoenproteine vom Eber, Bullen und Menschen im Westernblot auf ihre Immunreaktivität mit dem Antiserum untersucht. Um die funktionelle und strukturelle Analyse einzelner OAM‐Proteine zu erleichtern, wurden monoklonale Antikörper gegen die OAM durch Hybridisierung von Mausmyelom‐zellen mit den Milzzellen immunisierter Mäuse gewonnen. Eine Fusion führt zu etwa 100 Anti‐OAM Antikörper produzierenden Hybridomkulturen, von denen etwa 30% Kreuzreaktivität mit menschlichen Spermatozoen und Bullenspermatozoen zeigen. Von den etwa 20 stabilen Zell‐Linien, die Anti‐OAM IgG sezernieren, wurden vier für weitere Untersu‐chungen ausgewählt und die monoklonalen Antikörper mittels ELISA und indirekter Im‐munfluoreszenz charakterisiert. Im Gegensatz zu dem polyklonalen Mausserum gegen die OAM zeigen die monoklonalen Antikörper L81, L234, L264 in der indirekten Immun‐fluoreszenz ein granuläres Fluoreszenzmuster an der akrosomalen Kappe. L234 kreuzrea‐giert mit menschlichen Spermatozoen. Hochauflösende Gelfiltration in der HPLC kombi‐niert mit Elisa liefert erste Hinweise auf das korrespondierende Protein der OAM.