Protection of Polynucleotide Phosphorylase by Substrates against Urea Inactivation

Polynucleotide phosphorylase from Escherichia coli is irreversibly inactivated by preincubation with urea at concentrations of 3.0 M or greater. The addition of ribonucleotide polymers, oligonucleotides or nucleoside diphosphates to the preincubation medium markedly decreases the rate of this inactivation. Both oligonucleotides terminated with an unesterified 3′‐hydroxyl group or esterified with a 3′‐phosphate are equally effective. The presence of 2.0 M and 4.0 M urea in the normal reaction medium results in a complete. inhibition of the polymerization of the nucleoside diphosphates UDP and ADP, respectively. Full enzymic activity can be regained either by diluting the urea or by addition of oligonucleotides terminating with an uneserified 3′‐hydroxyl group. Long polynucleotides or oligonucleotides with a terminal 3′‐phosphate group are ineffective in restoring enzymic activity, in contrast to their ability to protect on the enzyme against irreversible denaturation. The phosphorolysis reaction catalyzed by polynucleotide phosphorylase is appreciably inhibited only at concentrations of urea in excess of 4.0 M. The present results suggest that at concentrations of 4.0 M or less, urea inhibits selectively and reversibly the chain initiation reaction either by drastically decreasing the binding constant of the oligonucleotide to the enzyme, or by slowing down the first steps of the polymerization. La polynucléotide phosphorylase extraite de Escherichia coli est inactivée de façon irréversible à la suite d'une pré‐incubation avec de l'urée à des concentrations de 3 M ou plus. Cette inactivation est notablement diminuée par l'addition de polyribonucléotides, d'oligonucléotides ou de nucléosides diphosphates au milieu de préincubation. Les oligonucléotides sont actifs, qu'ils soient terminés par un groupe 3′‐hydroxyle libre, ou qu'ils soient estérifiés en 3′ phosphate. En présence d'urée (2 M et 4 M, respectivement pour l'UDP et l'ADP) la polymérisation des nucléosides diphosphates est complétement inhibée. L'activité enzymatiquement peut être totalement rétablie, soit par dilution de l'urée, soit par addition d'oligonucléotides terminés par un groupement 3′ hydroxyle non estérifié. Les longs polynucléotides de même que les oligonucléotides terminés par un groupement 3′ phosphate, ne peuvent restaurer l'activité enzymatique, bien qu'ils puissent protéger l'enzyme contre une dénaturation irréversible. La réaction de phosphorolyse catalysée par la polynucléotide phosphorylase n'est inhibée de façon appréciable par la présence d'urée qu'à des concentrations au dessus de 4 M. Ces résultats suggèrent qu'à des concentrations de 4 M ou moins, l'urée inhibe la réaction d'initiation de la chaîne polynucléotidique de façon sélective et réversible; cette inhibition se produit soit par une forte diminution de la constante d'association entre l'oligonucleotide et l'enzyme, soit par un ralentissement des premières étapes de la polymérisation.