A Method for the Isolation of Highly Enriched Human Plasminogen from a Residual Globulin Fraction *

Summary For the preparation of larger amounts of human plasminogen one depends upon the availability of a suitable residue fraction from a plasma fractionation center. The method of isolation has to be adapted according to the composition of this starting material. A method has been worked out for the isolation of a highly enriched plasminogen preparation from the residual globulin fraction B as obtained in the fractionation of pooled plasma according to Nitschmann, Kistler and Lergier [5, 81. The seven steps of the procedure are a succession of precipitations and extractions and no operation is involved which could not be easily carried out on a large scale. Conditions are such as to facilitate the reproducibility of the results. The effectiveness of the single steps in the purification process was determined mainly by means of the tosylarginine‐methylester (TAME) hydrolysis measured in a pH‐stat after activation of the preparations with streptokinase. The analytical method is described in detail. According to this method, the final preparations of plasminogen are about 30 times as active as the starting material (fraction B) and 100–110 times as active as pooled plasma when solutions of identical protein conrentration are compared. The purification factor appears much higher when based on measurements of the caseinolytic activity. The yield is about 20% of the activity in plasma and more than 30 % of the activity in the starting material. According to studies in the ultracentrifuge and with the immunoelectrophoresis, the final preparation is not a homogeneous protein. The plasminogen can be pasteurized in solution at pH 4 (10 hours at 60° C) with only little loss of activity. Activation can be achieved by streptokinase, by urokinase or spontaneously in 50% glycerol. The activated preparation shows a high fibrinolytic activity in vitro. Résumé La préparation de quantiéks importantes de plasminogène humain dépend de l'existence d'une fraction riche en ce proferment provenant d'un centre de fractionnement du plasma. La méthode d'isolation doit être adaptée à la composition de cette fraction initiale. Les auteurs ont mis au point une méthode permettant d'obtenir une priparation très riche en plasminogène à partir du résidu de la fraction globulinique B; cette fraction provient du fractionuement d'un «pool» de plasmas selon Nitschmann, Kistler et Lergier [5, 81. La méthode comprend sept étapes, consistant en une succession de précipitations et d'extractions; elle ne comporte aucune opération pi ne pourrait être facilement effectuée sur une large échelle; les conditions sont prévues pour faciliter la reproductibilité des résultats. L'efficacité de chaque étape du procédé de purification a été déterminée principalement par la méthode de l'hydrolyse du tosylarginineméthylester (TAME) mesurée dans un pH‐stat après activation des préparations par la streptokinase. La méthode analytique est décrite en détail. Par cette mithode les préparations finales de plasminogène sont à peu près 30 fois plus actives que la fraction initiale (fraction B) et 100 à 110 fois plus actives que le «pool» plasmatique, quand on compare des solutions de teneur protidique identique. Le facteur de purification parait beaucoup plus élevé quand il est basé sur la mesure de l'activité caséinolytique. Le rendement est environ de 20% de l'activité du plasma et de plus de 30% de l'activité de la fraction initiale. L'étude de la préparation finale en ultracentrifugation et en immuno‐électrophoèse montre qu'il ne s'agit pas d'une protéine homogéne. Le plasminogène peut être pasteurisé en solution à pH 4 (10 h à 60°C) sans qu'il résulte une perte d'activité appriéiable. Son activation peut être réalisée par la streptokinase, l'urokinase, ou spontanément dans du glycérol à 50%. La préparation activée est douée d'une forte activité fibrinolytique in vitro. Zusummenfassung Zur Gewinnung größnerer Mengen von humanem Plasminogen ist man auf eine Restfraktion aus einem Plasmafraktionierungszentrum angewiesen, in der sich dieses Proferment angereichert findet. Die Isolierungsmethode wird sich nach der Zusammensetzung des Ausgangsmaterials zu richten haben. Es wurde eine Methode ausgearbeitet fůr die Gewinnung eines hochangersicherten Plasminogenpräparates aus der Restglobulinfraktion (B), die bei der Fraktionierung von Mischplasma nach Nitschmann, Kistler und Lergier [5, 8] anfällt. Das ***7stufige Verfahren wird genau beschrieben. Die Bedingungen sind so präzisiert, daß die Ergebnisse gut reproduzierbar sind. Es werden nur Fällungen und Extraktionen ausgeführt, so daß sich das Verfahren ohne weiteres in praktisch beliebig großen Ansätzen durchführen Iäßt. Der Erfolg der Anreicherung wurde vor allem durch Messung der TAME‐Spaltung im pH‐Stat nach Streptokinaseaktivierung kontrolliert. Die Analysemethode wird näher beschrieben. Die Schlußpräparate zeigen nach dieser Meßmethode einen Anreicherungsfaktor von etwa 30 gegenüber dem Ausgangsmaterial und von 100–110 gegenüber Mischplasma. Die Anreicherungsfaktoren, die durch Caseinolysemessungen angezeigt werden, sind viel höher. Die Ausbeute beträgt über 300%, bezogen auf die Ausgangsfraktion und etwa 20 % bezogen auf Plasma. Ein einheitliches Protein liegt nach Untersuchungen in der Ultrazentrifuge und mit der Immunoelektrophorese nicht vor. Unser Plasminogenpräparat läßt sich bei pH 4 ohne wesentlichen Verlust pasteurisieren (10 Stunden bei 60° C). Die Aktivierung kann in bekannter Weise durch Streptokinase, Urokinase oder spontan (in 50%igem Glycerin) erfolgen. Das aktivierte Präparat ist in vitro fibrinolytisch hochwirksam. Klinische Versuche stehen noch aus.