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Enzymatischer oder In‐vivo‐Einbau von Propargylgruppen in Kombination mit Klick‐Chemie zur Anreicherung und Detektion von Methyltransferase‐Zielsequenzen in RNA
Author(s) -
Hartstock Katja,
Nilges Benedikt S.,
Ovcharenko Anna,
Cornelissen Nicolas V.,
Püllen Nikolai,
LawrenceDörner AnnMarie,
Leidel Sebastian A.,
Rentmeister Andrea
Publication year - 2018
Publication title -
angewandte chemie
Language(s) - German
Resource type - Journals
eISSN - 1521-3757
pISSN - 0044-8249
DOI - 10.1002/ange.201800188
Subject(s) - chemistry , microbiology and biotechnology , biology
Abstract Die präzise, transkriptomweite Kartierung von m 6 A‐Positionen, einer der häufigsten internen Modifikationen in eukaryotischer mRNA, ist von großem Interesse. Eine Polymerase‐basierte Detektion von m 6 A ist schwierig, da die Modifikation keinen Einfluss auf die Watson‐Crick‐Basenpaarung hat. Ein chemisch‐biologischer Ansatz wurde entwickelt, der die präzise Kartierung von Zielsequenzen von Methyltransferasen (MTase) durch Einbau einer bioorthogonalen Propargylgruppe in vitro und in Zellen ermöglicht. Die Propargylgruppe wird hierbei enzymatisch von Wildtyp‐METTL3‐METTL14 angebracht. Nach Biokonjugation und Reinigung bricht die reverse Transkription an den m 6 A‐Positionen in 65 % der Fälle ab. Dies ermöglicht die Detektion der METTL3‐METTL14‐Zielsequenzen durch Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation. Der metabolische Einbau von Propargylgruppen in MTase‐Zielsequenzen gelang auch in vivo mithilfe von Propargyl‐ l ‐selenohomocystein; so konnten bekannte rRNA‐Methylierungsstellen validiert werden.