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Analyse von Struktur‐Aktivitäts‐Beziehungen bei Enzymen durch Protein‐Engineering
Author(s) -
Fersht Alan R.,
Shi JianPing,
Wilkinson Anthony J.,
Blow David M.,
Carter Paul,
Waye Mary M. Y.,
Winter Greg P.
Publication year - 1984
Publication title -
angewandte chemie
Language(s) - German
Resource type - Journals
eISSN - 1521-3757
pISSN - 0044-8249
DOI - 10.1002/ange.19840960704
Subject(s) - chemistry , microbiology and biotechnology , stereochemistry , biology
Die Beziehung zwischen Struktur und Aktivität von Enzymen kann heute erstmals durch systematische Veränderung der Proteinstruktur analysiert werden. Die rapide Entwicklung der DNA‐Rekombinations‐Techniken einerseits und die Erarbeitung leistungsfähiger Methoden zur chemischen Synthese von DNA‐Fragmenten andererseits ermöglichen es, auf einfache Weise Proteine durch spezifische Mutation der entsprechenden Gene gezielt zu verändern. Die kinetische Analyse von Mutanten‐Enzymen und die durch hochauflösende Röntgen‐Kristallographie erhaltenen Befunde lassen direkt Rückschlüsse auf die Beziehung zwischen Struktur und Funktion zu. Insbesondere können jetzt Enzym‐Substrat‐Wechselwirkungen und deren Bedeutung für Katalyse und Spezifität detailliert untersucht werden. Den gezielten Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren eines Proteins – eine „ortsspezifische Mutagenese” („site‐directed mutagenesis”) führten wir exemplarisch zur Analyse der Struktur‐Funktions‐Beziehung an der Tyrosyl‐tRNA‐Synthetase aus Bacillus stearothermophilus durch; dabei konzentrierten wir uns auf das Studium der Rolle der Wasserstoffbrückenbindungen für Substratspezifität und Katalyse. Die Bindung von Tyrosin und ATP kann nur unter Berücksichtigung der Austauschreaktion mit den Wassermolekülen der Hydrathülle verstanden werden. Diese Tatsache und die Kenntnis der detaillierten Struktur ermöglichten es uns, ein Enzym mit erhöhter Substrataffinität maßzuschneidern. Durch ein solches „Protein‐Engineering” können Enzyme mit neuen Spezifitäten, Aktivitäten und Struktureigenschaften gewonnen und direkte Einblicke in die Art und Weise der Enzymkatalyse erhalten werden. Wir fanden beispielsweise, daß die Katalyse der Bildung von Tyr‐AMP aus Tyr und ATP hauptsächlich auf elektrostatischen Kräften und Wasserstoffbrückenbindungen beruht, die im Übergangszustand stärker als im Grundzustand sind – ein „strain”‐Mechanismus also und weniger eine Säure‐Base‐Katalyse oder eine kovalente Katalyse.