Role of Interaction of BA and 2,4 – D in the Growth and Differentiation of the Callus of (Nigella sativa L.) Plants and Their Relation with the Level of Its Effective Compounds

This study demonstrated the role of some standard growth regulators in the induction, growth and differentiation of callus of Nigella sativa L.. Benzyl Adenine (BA) and 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) were used with concentrations (10, 10 , 10 , 10 , 10 ) molar for each separately on one hand and their interference’s. The results show that the best media for the induction and growth of callus are those which contain 2,4-D (10)M as the fresh weight of the growing callus reached (3.58), (12.89) gm at 45,75 days respectively. Also best differentiation among shoots was with the media supplying 2,4-D (10)M with BA (10)M. But, the root growth was not observed before the callus reached the age of 100 days on the media which contain 2,4-D alone. This study explored the content of the callus of black seed plant like the active compounds and their comparison with the seeds contents. This was carried out using high performance liquid chromatographic technique HPLC. This technique proved that the callus content of active compounds almost equal or higher than those in the seeds bearing in mind that callus content differs according to the used growth regulator,it was found that compounds separated according to their Retention time which ranged between 4to 14 mint ,these compounds were closely similar ( according to the separated peaks) those compounds separated from the seed extract (Alcohol soluble phase). ةمدقملا نا عطتسـي مـل ناسنلاا نا لاا ةثيدحلا ةيعانصلاو ةينلاديصلاو ةيبطلا تاينقتلا مدقت نم مغرلا ىلع لا ىلع لب جلاعلل تابنلا نع ينغتسي ةجاحلا تدادزا سكع لـيثم هل قبسي مل لكشب هل ) لـيباق ، 1998 ( . ةجسـنلاا ةـعارزل ةفلتخملا تاينقتلا نم ةدافتسلاا ىلا ةيودلاا ةعانصب ةمتهملا تاربتخملا ضعب ىعستو ةـيئاودلا تاعانصـلا يـف لخدـت يـتلا ةيتابـنلا ةيوايميكلا تابكرملا ضعب ىلع لوصحلا يف ةيتابنلا مل كـلذو ةفلتخـملا اوف نم ةينـقتلا هذه همدقت ا يبطلا تابنلاب ةنرتقم ةديدـع دئ ، ) ناملـس , 1988 .( ذا تاـبنلا نـم ةلوصفملا كلت قوفت دق ةيلاع ةواقن ةجردبو ربكا تايمكب تابكرملا هذه ىلع لوصحلا نكمي متسم نوكي اهجاتنإ ناف كلذكو ،لماكلا اهتعارز مسوم ىلع دمتعم ريغو ً ار سـلا ةيناكما نع ً لاضف ، ةرطي جاتنإ ىلع ةماتلا و ةمهملا تابكرملا نم ددـع ـ ختسملا كلـتك مادختسلاا ةرطخلا رـيدخـتـلا يف ةمد نيـفروـملاك ) محم ،رمعو د 1990 ( ريقاقعلاو ةيبطلا داوملا جاتنإ نا لاجملا اذه يف ركذلاب ريدجلا نمو هنم لماوع ةدعب رثأتي ةجسنلأا ةعارز قيرط نع اهريغو لا ءزجلا ةعيبط ا ةـعارزلل مدختسـم explant ع باحر حلاصلا ديعس ءانه و ركبلا رابجلا دب 224 ظـفح فورــظو عرزـلل مدختـسملا يئاذغلا طـسولا تانوكمو ةلاعفلا ةداملل هجاتنإ ةيمكو هردصمو ةءاضا نم تاعورزلا ةرارحو ةيوهتو ) Dixon, 1985 Collin, 1987; ( ىـلع رشابم لكشب رثؤت يتلاو ةيتابنلا ةيلولاا جتاونلا ) et al., 1998 Youssef ( رثؤت يلاتلابو فلتـخت يتلا ةيوناثلا ةيضيلاا داوملا ىلع ةيلولاا ةيضيلاا داوملا نم قتشتو ً ايويح ) Bhalsing and Maheshwari, 1998 ( ةرثؤـملا لماوعلا نمو ذـغلا طـسولا ىـلا ةفاضـملا ومنلا تامظنم زيكرتو عون لاجملا اذه يف ةيبطلا ريقاقعلا جاتنا ىلع يئا و تانيسكولاا ةصاخو مدختسملا وتياـسلا ءاـنب يفو ةـيتابنلا ةعرزـملا زيامتو ومن يف ةرثؤملا تانينياك ةعارزلا يف مدختسملا يتابنلا ءزجلا عون كلذكو ةيوناثلا ةيضيلاا جتاونلا ) Collin, 1987 ( . نـم حبصاو ةيعيبطلا داوملا صلاختسا بعصلا ) يلاا داوملا ةيوناثلا ةيض ( ضرعتل ةجيتن يقن لكشبو تابنلا نم ةلوهسب تائيبلا كـلذل ،يئيبلا رارقتسلاا مدع تلااح نم ديدعلا نع ً لاضف ةيقيقح رطاخمل ةيربلا تاتابنلل ةيعيبطلا هذهل ردصملا دعت يتلا تاتابنلل ةيديلقتلا ةعارزلل لمتحملا بسانملا ليدبلا ةيجيسنلا ةعارزلا تاينقت تحاتا ةماهلا ةيضيلاا تابكرملا ) ،ينانكلا 1987 ، Bhalshng Maheshwari, 1998 ، Youssef et al., 1998 .( لمعلا قئارطو داوملا ءادوسلا ةبحلا روذب تمقع Nigella sativa L. ، لوـلحمب لاوأ اهرمغب ايحطس اميقعت 96 % نـم مويدوصـلا تــيارولكوبياه لولحم ىلا ذئدعب تلقن ،نيتقيقد ةدمل يليثلاا لوحكلا ) NaOCl ( Sodium hypochlorite نم رطقملا ءاملا عم ففخملا زكرملا يسيئرلا لولحملا ) 6.4 (% ةبسنبو ) 1 مجح : 2 ح مـج ( ) رصاق : ءام ( ةرتفلو 4 5 قئاقد , مقعملارطقملا ءاملاب روذبلا لسغ اهبقعأ 5 7 تامقعملا راثآ ةلازلإ تارم ،اقباس ةلمعتسملا ) ،ركبلا 2002 ( ، طـسو ىلعةمقعملا روذبلا تعرز Arnon و Hagland ) Arnon and Hagland, 1940, 1944 ( لصلا ب ةيمنتو روذبلا تابنلإ مقعملا تاردابلا ةيواحلا ناقيسلا عطق تمدختساو ، وطب ةدـقعلا نم ةيلاخ ىرخأ عطقو ةدحاو ةدقع ىلع ل 1 1.5 رـمعبو تاردابلا نم مس 21 – 24 موـي عطق ثلاث لدعمبو / تعرز ،ةنينق طسو ىلع Murashige and Skoog, 1962) MS ( زـهجملا بلصـلا نـم ةـفلتخم تايوتسـمب ) BA ( Benzyl Adenine ، ) 2,4-D ( Dichlorophenoxy acetic acid 2,4زيكارتبو ) 10,10,10,10,10 ( لاوم امهتلاخادـتو ادح ىلع اهنم لكل ر ، يئاذـغلا طـسولا عزو ختسملا ينانقلا ىلع يواستلاب عقاوب ةعارزلل ةمد 20 لم / ةنينق . عطقلا ىلع ةيواحلا ةيجاجزلا ينانقلا تلقن ةيتابنلا ةءاضأ ةدشب ومنلا ةنضاح ىلا ةعورزملا 1500 سكول , يموي بقاعتبو 16 و ءوض ةعاس 8 تاعاس ةرارح ةجردبو ملاظ 22ْ م . دـيدحتو ءادوسـلا ةـبحلا تارداب عطق نم ثدحتسملا سلاكلا ةمادإ تمتو رورم دـعب روذجلاو ةيرضخلا عرفلاا نيوكتو سلاكلا ثادحتسلا ةيتابنلا عطقلا ةباجتسا 45 و 75 ً اـموي يئاذغلا طسولا ىلع اهعرز نم . نم ةكرتشملا تلاخادتلا رود ) BA ( و ) 2.4D ( ومن يف 223 حكلا تاصلختسملا ريضحت ءادوسلا ةبحلا روذبو سلاكل ةيلو : ثــ حابلا ةــ قيرط تــ عبتا ) 1988 ( . et al. Grand ةيــ ساسلاا ةــ قيرطلا نــ ع ةروــ حملا ) 1982 et al., Verpoorte ( يلوحكلا صلختسملا ريضحت يف ، يماـنلا ءادوسـلا ةبحلا سلاك مدختساو ، طسو ىلع MS احلا ىلع يو 10 ومنلا مظنم نمرلاوم D 2,4 زيفحتل لثملاا زيكرتلا هرابتعاب ثادحتسا ةساردلا هذه يف سلاكلا . مدختساو 20 يـب حوارت رمعب سلاكلا نم مغ ن 100 110 ريضـحت يـف موـي صلختسملا ذخا ، 0.1 بيذأو ففجملا سلاكلا صلختسم نم مغ يف 2.5 لولحم نم لم 60 % لوناثيم ، مث داوملا تبسر هيف ةقلاعلا رطلاب ةعرسب يزكرملا د 5000 د / ةدملو د 5 قئاقد . ببسـبو روذـبلل ةبسنلاب امأ صلختسملا لصفو هلاعأ ةروكذملا فورظلا سفنب بيسرتلا مت اضيأ صلختسملا يف تويزلا ةبسن عافترا ا لوحكلا يف بئاذ ءزجو يتيز ءزج ىل اركوتاموركلا ةينقت يف ةدرفنم ةروصب ةنيع لك رابتخا متو ، اـيف ةنراقمو اهيف تابكرملا صيخشتل سلاكلا نم ةقباسلا ةنيعلا عم كلذ . ءادلأا وذ لئاسلا فاركوتاموركلا زاهج مدختساب ءادوسلا ةبحلا روذبو سلاك يف ةلاعفلا تابكرملا لصف قئافلا : High-Performance Liquid Chromatography / HPLC روصب ةلاعفلا تابكرملا دوجو نع فشكلا مت زاـهج ةطاسوب ءادوسلا ةبحلاروذبو سلاك يف ةماع HPLC ةكرش نمزهجملا ) LKB ( عون لصف دومع مادختساب ، : mm ) 5 × Partisile 10 silica (250 كرحتملا روطلا Mobile phase : يليثملا لوحكلا مدختسا Methanol 60 % يذلا كرحتملا روطلا لثميل لوزن يف مهاسيو لصفلا ءانثأ ةنيعلا لمحي عيمج تدرطو هحيشرت مت نا دعب لصفلا دومع للاخ تانيعلا ةيتوصلا قوف تاددرتلا زاهج مادختساب هنم تازاغلا Sonicator . ناـيرج لدـعمبو Flow rate = 0.4 لم / ةيصاصتملاا ىدمو ةقيقد range Absorbanse = 0.02 دنعو يجوـم لوط Wave length = 252 تابكرملا روهظ تقو نروقو ،رتيمونان ) ز سابتحلأا نم ( Retention time عـم سلاـكلا صلختسم يف ظ تقو روذبلا تاصلختسم يف تابكرملا روه . جــئاتنلا لاوا ريثأت BA و D 2,4 سلاكلا ثادحتسا يف : ا ءادوسلا ةبحلا تارداب عطق ترهظ ) اهنم ةيلاخلاو ةدقع ىلع ةيواحلا ( طاـسولاا ىـلع ةعورزملا ىلع ةيواحلا BA و D – 2,4 زيكارتب سلاـكلا ثادحتسلا ةمزلالا ةينمزلا ةرتفلا يف ةتوافتم ةباجتسا ةفلتخم نيب تحوارت 12 25 ً اموي ) لودجلا 1 .( ىـلع ةـعورزملا عطقلا يف تلصح ةباجتسا لضفا نا دجوو ـب ةزهجملا ةيئاذغلا طاسولاا 10 نم رلاوم – D 2,4 زيكارت عم وا هدحول ءاوس BA ةرـتف تقرغتساو ، نيب تحوارت ةينمز 12 18 اهيــلا فاضـملا طاسولاا ناف كلذـك ً اـموي -6 10 و 10 و 10 رلاوـم ع باحر حلاصلا ديعس ءانه و ركبلا رابجلا دب 224 D 2,4 عم 10,10,10 رلاوم BA يـف ةعورزملا ةيتابنلا عطقلا نم سلاكلا ثادحتسلا ةزفحم تناك ً ايبسن ةليلق ةينمز ةرتف ) لودجلا 1 .( ةـيواحلا ةـيئاذغلا طاسولاا ىلع ةعورزملا ةيتابنلا عطقلا نا ظحولو ىلع 10 نم رلاوم D 2,4 زيكارت عيمج عمو هدحول BA ً اـقلطم ةباجتـسا اهيف لصحي مل ةمدختسملا تومو لوبذ نم عطقلا تناع امناو للاخ 10 ةعارزلا نم ىلولاا مايا . لا لودج 1 : ةينمزلا ةرتفلا ) مايلااب ( تاــبن تارداـب ناقيس عطق نم سلاكلا ثادحتسلاةمزلالا دوسلا ةبحلا طاسوا يف ءا MS دوجوب BA و D 2,4 . سلاكلا ثادحتسإ ) مايلأاب ( 10 10 10 10 10 2,4-D ) رلاوم ( BA ) رلاوم ( --13 12 14 16 10 16 --17 15 17 16 10 16 --15 12 15 14 10 ----20 13 16 15 10 ----22 18 25 25 10 ----22 18 25 25 تارركملا ددع 5 ةلماعم لكل . --: زيفحت دجوي لا ايناث : ريثأت BA و D 2,4 سلاكلل يرطلا نزولا ىلع : ــب ةزهجملا طاسولاا يه سلاكلا ومنو ثادحتسلا ةعجشملا طاسولاا لضفا نا جئاتنلا تنيب 10 رلاوم D – 2,4 ملا زيكارتلا دوجوب وا هدحول ءاوس نم ةفلتخ BA سلاـكلل يرطلا نزولا حوارت ثيح ، طاسولاا هذه ىلع يمانلا 3 4 عب مارغ رورم د 45 ةعارزلا ءدب نـم ً اموي ف طاـسولاا ةـيقب اما ، اـهنا لقا ةجردبو سلاكلا ومن تزفح منو ثادحتسلا ةباجتسا لصحت ملو ، ىـلع ةعورزملا عطقلا نم سلاكلا و ةيواـحلا طاسولاا 10 رلاوم D – 2,4 س زيكارتلا دوجوب وا هدحول ءاو نم ةفلتخملا BA ) لودـجلا 2 .( رورم دعب سلاكلل يرطلا نزولا يف ةدايز ربكا لوصح جئاتنلا تدكاو 75 يـف ةـعارزلا ءدب نم ً اموي ةزهجملا ةيئاذغلا طاسولاا زيكرتب 10 نم رلاوم D 2,4 نزو غلب ثيح هدحول اـهيلع يماـنلا سلاكلا رادقم 12.8 مارغ اهيلت ، ـ ب ةزهجملا طاسولاا 10 رلاوم D 2,4 زيكارت عيمج عم BA ةـصاخ 10 هنم رلاوم ىلع ةيواحلا طاسولاا اهدعب يتأتو ، 10 رلاوم D – 2,4 عم 10,10 رلاوم BA كلذـكو ىلع ةـيواحلا طاسولاا 10 رلاوم D 2,4 عم 10 رلاوم BA يرـطلا نزوـلا يف ةدايز تظحولو ىلع يمانلا سلاكلل ـ سولاا ةيقب لقا ةجردب نكلو ةماـع ةروصب طا ) لودجلا 3 .( سلاـكلا زيمت ً امومعو اهيلا فاضملا طاسولاا ىلع يمانلا D 2,4 و BA هماوقب قارـبلا رضـخلاا هنولو ككفتلا ريثكلا جزللا ) ةروصلا 1 ( ةـيئاذغلا طاـسولاا ىـلع يماـنلا سلاكلا زيمت امك ، رفصلاا ىلا تانيعلا ضعب يف ليمي نم ةكرتشملا تلاخادتلا رود ) BA ( و ) 2.4D ( ومن يف 223 جملا ـب ةزه 10 رلاوم D 2,4 زيكارـت عـيمج دوجوب وا هدحول ءاوس BA نكادـلا رفـصلاا هنولب يوكت ةيادب ذنم سلاكلا يف نوللا اذه دوجو رمتساو ومنلا نم ةريخلاا رامعلاا ىتح هن . لا لودج 2 : سلاكلل يرطلا نزولا لدعم ) مارغ ( و يضم دعب ءادوسلا ةبحلا تابنل ةيرضخلا عرفلاا زيامت ) 45 ( طاسوا ىلع ةعارزلا نم ً اموي ) MS ( ـلا نم ةفلتخم زيكارتب ةزهجملا ةيئاذغلا BA و 2.4 -D . 10 10 10 10 10 BA زيامتلا نزولا يرطلا زيامتلا نزولا يرطلا زيامتلا نزولا يرطلا زيامتلا نزولا يرطلا زيامتلا نزولا يرطلا 2,4D M BA M --1.337 0.178 ± 3.585 0.324 ± * 0.914 0.701 ± * 0.502 0.282 ± زيكرتلا زيامتلا نزولا يرطلا 10 ----3.742 0.199 ± ** 0.8 0.232 ± * 0.983 0.453 ± 10 --* 1.357 0.161 ± 3.0 0.155 ± * 0.655 0.105 ± * 2.122 0.347 ± 10 --0.374 0.05 ± 4.308 0.225 ± * 0.992 0.202 ± ** 0.7 0.079 ± 10 --1.242 0.287 ± * 4.224 0.728 ± * 0.322 0.013 ± * 0.274 0.033 ± 10 --0.788 0.083 ± *