Desarrollo, producción y caracterización parcial de un fragmento variable de Ig de cadena sencilla fusionado al Fc de la IgG1 humana (scFv-Fc) con especificidad anti-HER2

Due to their versatility and simplicity of production, single chain Fv fragments (scFvs) derived from antibodies have become popular tools for a variety of applications. Among these applications are the immunodetection of specific targets, imaging diagnostics and immunotherapy. In this work, we developed a stable cell line capable of producing a human scFv directed against the tumor antigen HER2 fused to the Fc of the human IgG1 (scFv-Fc antiHER2). This cell line derives from CHO cells and has been stably transfected using a modified version of the commercial vector pSecTag A, which contains the sequence of interest. The resulting transfectants produced the scFv-Fc antiHER2 fusion protein, which is present as a homodimeric molecule in culture supernatants. By using flow cytometry assays, it was shown that the scFv-Fc anti-HER2 molecules bind specifically to HER2 on the surface of SKBR-3 cancer cells, as well as to the FcγR receptors expressed on human leukemic monocytes (THP-1). This new cell line provides the starting material for the production and purification of the scFv-Fc anti-HER2 fusion protein, which will be tested in animal models as a novel tool for immunodiagnosis and/or breast cancer immunotherapy. Recibido: 15-08-2016 Aceptado: 23-05-2018 Fragmento de anticuerpo anti-HER2 201 Vol. 59(3): 199 215, 2018 dad en el diagnóstico, detección o terapia del cáncer están comúnmente dirigidos a antígenos específicos que son expresados de manera casi exclusiva o de forma exacerbada en las células tumorales. Los receptores de factores de desarrollo epidérmico constituyen blancos importantes para varias de estas moléculas. Estos receptores forman parte de una familia de moléculas que están involucradas en la promoción de eventos de proliferación y sobrevivencia celular. Entre los receptores de factores de desarrollo epidérmico destaca el de tipo 2 (llamado HER2 en el humano), para el que ya se han comercializado dos anticuerpos terapéuticos: Trastuzumab (Herceptin, Genentech) y Pertuzumab (Perjeta, Roche) (9,12). A pesar de las notables mejoras en las respuestas clínicas obtenidas con la aplicación de los anticuerpos terapéuticos, algunas de sus propiedades deben ser modificadas para incrementar su capacidad de penetración al tumor, aumentar su internalización por parte de las células tumorales y/o evitar el desarrollo de resistencia al tratamiento. Además, se requiere del desarrollo nuevos reactivos con mayor poder de predicción de la respuesta al tratamiento, de manera de emplearlos solo en aquellos casos donde exista mayor probabilidad de éxito. Por otra parte, resulta imperativo el desarrollo local de este tipo de tecnologías para promover su producción, validación y comercialización a nivel nacional y regional. Con la finalidad de contribuir con estos objetivos, hemos diseñado mediante tecnología de ADN recombinante un scFv-Fc anti-HER2 para expresarlo en células CHO. Los scFv tienen un gran potencial biotecnológico ya que, en comparación con los anticuerpos completos, pueden ser producidos con mayor facilidad debido a su pequeño tamaño, lo que a su vez les confiere una mayor capacidad de penetración en tumores sólidos y presentan, además, una menor posibilidad de inducir una respuesta inmunitaria que promueva su eliminación (13). Al acoplar el fragmento Fc de la IgG1 al scFv, se promueve que éste pueda mediar funciones efectoras de células del sistema inmunitario, las cuales son de gran importancia para la actividad antitumoral de los anticuerpos (14), prolongando además su vida media en suero gracias a la interacción con el receptor neonatal para Fc (FcRn). MATERIALES Y MÉTODOS Construcciones genéticas Para la construcción del vector de expresión que porta la fusión genética de interés se emplearon los vectores tipo plásmido pSecTag A y pSYN (gentilmente donados por el Dr. Bruno Roberts y la Dra. Marie-Alix Poul, respectivamente, ambos del Instituto de Investigación de Cáncer de Montpellier, Francia). La versión de pSecTag A utilizada contiene una secuencia que codifica un scFv anti-CEA (Antígeno Carcinoembrionario) fusionado a los dominios constantes CH2 y CH3 de la cadena pesada de la IgG humana del isotipo γ1 provenientes del vector comercial pFUSE-hIgG1-Fc (Invivogen). El plásmido pSYN contiene la secuencia correspondiente a la especificidad anti-HER2. El ADN plasmídico de ambos vectores fue digerido de forma secuencial empleando las enzimas SfiI y NotI (Thermo Fisher Scientific), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los fragmentos resultantes se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se aislaron dos fragmentos de ADN: uno de aproximadamente 700 pares de bases (bp), proveniente del vector pSYN y otro de aproximadamente 6 000 bp, proveniente del vector pSecTag A modificado. Estos fragmentos fueron ligados empleando Ligasa T4 (New England Biolabs, RU), siguiendo las recomendaciones de la casa comercial. Posteriormente, los productos del ligamiento fueron clonados en bacterias E. coli de la cepa DH5-, purificados empleando un estuche comercial de minipreparaciones (Clontech, EUA) y secuenciados en el Servicio de Secuenciación de ácidos nucléicos del IVIC (15). 202 Gámez-Hoyos y col. Investigación Clínica Vol. 59(3): 2018 Transfección El ADN plasmídico del vector de expresión construido fue producido a mayor escala e introducido en células CHO Pro-5. Se empleó la técnica de lipofección (Lipofectamine 2000, Invitrogen), siguiendo las recomendaciones del fabricante. La eficiencia de transfección se evaluó mediante microscopía de fluorescencia empleando un plásmido reportero (pMMP-mIL-12.IRES.eGFP, gentilmente donado por el Dr. Jesús Páez, Universidad de Harvard, EUA) que contiene la secuencia que codifica la proteína fluorescente verde. Posteriormente, se añadió la droga de selección (Zeocina) a la concentración óptima (0,25 μg/mL) previamente determinada y las placas se mantuvieron en la incubadora bajo observación continua hasta detectar la presencia de transfectomas resistentes. Para evidenciar la producción de la proteína de fusión se realizó un escrutinio del sobrenandante de los cultivos donde crecían células resistentes a la droga de selección, empleando para ello ensayos de Dot Blot y ELISA específicos para la IgG humana. Dot blot específico para IgG En una membrana de nitrocelulosa se repartieron alícuotas de 100 μL de cada sobrenadante cosechado de los cultivos de células productoras de la proteína recombinante, a través de un Bio-dot (Bio-rad, EUA). Posteriormente, la membrana fue sometida a vacío por 15 minutos y se dejó secar al aire por unos minutos más. Esta membrana se incubó luego con una solución tampón TBS (0,9% NaCl; 100 mM Tris; pH 7,5) con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% (TBSBSA 5%) a temperatura ambiente y en agitación durante 1 hora. A continuación, la membrana se lavó con TBS y se incubó en agitación y a temperatura ambiente con el anticuerpo específico para la porción Fc de la inmunoglobulina G humana conjugado a peroxidada (Sigma A-0170) durante 1 hora. Finalmente, la membrana se lavó 3 veces con TBS al que se le añadió Tween 20 al 0,1% (TBS-Tween 0,1%) para, posteriormente, incubarla a temperatura ambiente en solución de revelado DAB (650 μg/mL diaminobencidina; 0,01% H2O2 y 0,03% cloruro de cobalto, diluidos en tampón Tris-HCl 100 mM; pH 7) durante 30 minutos. ELISA específico para IgG Para realizar el ensayo de determinación de la concentración de proteína recombinante en los sobrenadantes de cultivo, se revistió una placa de ELISA con 100 μL/pozo de un anticuerpo de captura (Fab2 anti-Fc, Sigma I-9885) diluido a una concentración de 0,5 μg/mL en tampón PBS (5 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl; 0,85% NaCl; pH 7,2), incubándola a 4oC durante la noche. Después de 2 lavados con PBS frío, la placa se bloqueó con BSA diluido al 3% en PBS (PBS-BSA 3%) a 37oC durante 1 hora. Al finalizar dicha incubación, los pozos de la placa se lavaron con PBS-Tween 0,05% y se colocaron 100 μL/pozo de los sobrenadantes de cultivo o diluciones seriadas de un patrón comercial de IgG humana de concentración conocida por duplicados. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 90 minutos y se lavó 6 veces con PBS/Tween 0,05%. A continuación, se colocaron 100 μL/pozo del anticuerpo anti-IgG humana conjugado a peroxidada (Sigma A-0170) diluido en PBSBSA 3% y se realizó una nueva incubación a temperatura ambiente durante 90 minutos. Luego de lavar 4 veces con PBS-Tween 0,05% y una vez con PBS, se añadieron 50 μL/pozo de sustrato TMB (0,1 mg/mL tetrametilbencidina y 0,01% H2O2, diluidos en 20 mM ácido cítrico; 150 mM fosfato de sodio, pH 5,2) recién preparado, se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos y se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 0,5 N. Finalmente, se procedió a registrar los valores de absorbancia a 450 nm de cada pozo, empleando para ello un lector de ELISA (Bioteck Instruments, Burlington, EUA). Los valores de absorbancia obtenidos para la curva patrón se utilizaron para generar una Fragmento de anticuerpo anti-HER2 203 Vol. 59(3): 199 215, 2018 recta de regresión que permitió la estimación cuantitativa de las concentraciones de proteína de fusión en los sobrenadantes. Clonación La clonación se realizó mediante el método de dilución al límite. Una suspensión de 100 células/mL de cada transfectoma en estudio fue diluida seriadamente (1:2) hasta alcanzar la dilución que corresponde teóricamente a una concentración 6,25 células/mL. Cada dilución fue entonces repartida en una placa de cultivo celular de 96 pozos (a razón de 100 μL/pozo) en presencia de la droga de selección Zeocina (Invitrogen) y las placas resultantes fueron incubadas a 37°C, 5% CO2 durante aproximadamente 1 mes. Aquellas placas que presentaron colonias en menos de 30% de los pozos fueron sometidas a escrutinio mediante el ELISA específico para IgG, descrito en la sección anterior para determinar cuáles clones produjeron la mayor cantidad de proteína de fusión. Producción de so