Determinação do Perfil Metabolômico de Urina por GC-MS: Estudos Iniciais

Resumo A urina é uma matriz biológica complexa e composta por diversos metabólitos. A identificação de tais compostos por GC-MS pode ser dificultada, se a amostra não receber tratamento adequado. Neste trabalho usou-se a derivatização química dos metabólitos afim de iniciar a caracterização do perfil metabolômico de amostras de urina. Palavras-chave: Perfil metabolômico, Derivatização, GC-MS Introdução Durante os processos metabólicos, as células produzem metabólitos que fluem através da corrente sanguínea, são pré-concentrados pelos rins e excretados pela urina. Assim, a urina é um fluido biológico que tem sido bastante usado para estudos metabolômicos, devido a sua representatividade do metabolismo de um organismo e obtenção pouco invasiva. Uma das formas de obter o perfil metabolômico é através da cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (GC-MS), onde metabólitos intrinsecamente voláteis, ou as espécies derivatizadas, são separados com alta resolução e identificados inequivocamente pela retenção cromatográfica, massa molecular e estrutura, com auxílio de bibliotecas de dados completas e confiáveis, tais como a Agilent Fiehn Metabolomics Library1. Neste trabalho, são apresentados os estudos iniciais de preparo de amostras de urina de indivíduos sadios a serem analisadas por GC-MS, visando a identificação de espécies relacionadas ao metabolismo humano. Resultados e Discussão Foram coletadas 51 amostras de urina de indivíduos sadios no Hemocentro da Unicamp. Foi então preparado um pool das amostras que foi armazenado à -80 °C. Utilizou-se urease para catalisar a decomposição da ureia, que, junto com proteínas presentes na amostra, são precipitadas com metanol, pois podem prejudicar a detecção de metabólitos. Alíquotas do sobrenadante foram derivatizadas quimicamente, de forma convencional, utilizando os processos de metoximação e sililação, tornando grupos funcionais muito reativos em derivados voláteis e termicamente mais estáveis. Os sobrenadantes foram secos em fluxo de nitrogênio e reagiram por 16 h sob incubação com cloridrato de Ometoxiamina em ausência de luz. A sililação se deu a partir da adição de 30 μL de MSTFA com 1% de TMCS à 70 °C durante 1 h. O ácido pentadecanóico foi usado como padrão interno. As condições de análise por GCMS foram as descritas por Barbas et al. 2 Resumidamente: Volume de injeção: 1 μL (splitless); Fluxo de gás de arraste (He): 1 mL/min; Temperatura do injetor: 250 °C, hold time por 1 min; taxa de aquecimento: 3,3 °C/min; temperatura final: 340 °C; Transfer line: 280 °C; fonte de ionização por feixe de elétrons: -70 eV; faixa de relação m/z investigada: 50 – 650 Da à 5 espectros/s. As análises foram feitas em um GC-MS Agilent 5975C com coluna HP5MS de 30 m × 0,25 mm × 0,25μm. A análise por GC-MS foi feita em quadruplicata e o melhor cromatograma foi escolhido com base no número de picos detectados e melhor