Κυτταρογενετική και μοριακή διερεύνηση ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα

Το πολλαπλούν μυέλωμα (ΠΜ) είναι νεοπλασία των Β-κυττάρων και χαρακτηρίζεται από την κακοήθη υπερπλασία των πλασματοκυττάρων του μυελού των οστών. Τα κακοήθη πλασματοκύτταρα παράγουν μία μονοκλωνική ανοσοσφαιρίνη (Μ-πρωτεΐνη ή παραπρωτεΐνη) και προκαλούν διήθηση του μυελού, οστεολύσεις, αναιμία, νεφρική ανεπάρκεια και ευαισθησία σε μικροβιακές μολύνσεις. Η συχνότητα της νόσου υπολογίζεται σε 1 έως 2 περιπτώσεις ανά 100.000 άτομα, προσβάλλει κυρίως ηλικιωμένα άτομα, και ευθύνεται για το 1% των θανάτων που προκαλούνται από νεοπλασίες. Η πρόγνωση και η κλινική πορεία των ασθενών με ΠΜ ποικίλει, με χρόνο επιβίωσης από μερικές ημέρες έως και πάνω από 10 χρόνια. Επιδημιολογικές μελέτες έδειξαν ότι το ΠΜ στο ένα τρίτο των ασθενών προκύπτει από προϋπάρχουσα καλοήθη μονοκλωνική γαμμοπάθεια ενώ στους υπόλοιπους παρουσιάζεται παρακάμπτοντας προϋπάρχουσες καταστάσεις και κάποιες φορές με επιθετική εξέλιξη. Θα μπορούσε δηλαδή το ΠΜ να χαρακτηρισθεί σε δύο τύπους, πρωτογενές και δευτερογενές Αυτή η βιολογική και κλινική ετερογένεια της νόσου υποδηλώνει την εμπλοκή σύνθετων γενετικών μηχανισμών που καθορίζουν την παθογένεση και την εξέλιξη της νόσου μέσω διαφορετικών μονοπατιών. Η κατανόηση επομένως των γενετικών αυτών αλλαγών είναι καθοριστικής σημασίας για την πρόγνωση, κλινική παρακολούθηση και θεραπεία των ασθενών με ΠΜ.Η κυτταρογενετική μελέτη φαίνεται να συμβάλλει στην πρόγνωση και την πορεία εξέλιξης της νόσου αποκαλύπτοντας χρωμοσωμικές διαταραχές στο 20 - 30% των ασθενών με Π.Μ. Η εφαρμογή της μοριακής κυτταρογενετικής (φθορίζων in situ υβριδισμός, FISH) σε μεσοφασικούς πυρήνες έχει συντελέσει στην αύξηση της συχνότητας εμφάνισης ανωμαλιών σε ποσοστά που φτάνουν το 60% των ασθενών. Κάποιες ανωμαλίες φαίνεται να είναι τυπικές της νόσου και να σχετίζονται με την πρόγνωσή της. Οι συχνότερες χρωμοσωμικές ανωμαλίες αφορούν ελλείψεις των χρωμοσωμάτων 13 [del(13q)] και 11 [del (11q)], μεταθέσεις t(4;14), t(11;14), t(14;16), πολυπλοειδίες, υπερδιπλοειδίες, υποδιπλοειδίες, ψευδοδιπλοειδίες και παρατετραπλοειδίες.Πολύ πρόσφατα, βρέθηκε πως οι ποικιλομορφίες αριθμού αντιγράφων του ανθρωπίνου γονιδιώματος (Copy number variations ή CNVs) αποτελούν μια νέα πηγή πληροφορίας που αφορά στη δομή των χρωμοσωμάτων. Τα CNVs μπορεί να προέλθουν από προσθήκη, ή έλλειμμα, ή διπλασιασμό χρωμοσωμικών περιοχών, με μέγεθος από μερικές κιλοβάσεις (Kb) έως πολλές μεγαβάσεις (Mb) και μπορεί να έχουν επιπτώσεις στον αριθμό αντιγράφων ενός γονιδίου με συνέπεια τη μεταβολή της σύνθεσης της πρωτεΐνης (gene dosage), στην κατάργηση της λειτουργίας γονιδίων, στην αλλαγή της δομής γονιδίων, ή στην απορρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων. Με βάση τα παραπάνω, τα CNVs ενδέχεται να αποτελέσουν αιτία της φαινοτυπικής ποικιλομορφίας σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Όσο αφορά το ΠΜ η συνεχής μελέτη των CNVs σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, αναμένεται να υποστηρίξει την διαλεύκανση μηχανισμών που παίζουν σημαντικό ρόλο στη φαινοτυπική ποικιλομορφία των ανθρώπων και στη διαφορετική προδιάθεση μεταξύ των ατόμων στην ανάπτυξη της νόσου.Επίσης μελέτες έχουν εστιαστεί στους αυξητικούς παράγοντες του ΠΜ όπως οι κυτοκίνες. Οι κυτοκίνες είναι πρωτεΐνες ή γλυκοπρωτεΐνες που ρυθμίζουν την επικοινωνία μεταξύ ανοσολογικών και μη ανοσολογικών κυττάρων και ασκούν χαρακτηριστική δράση στον πολλαπλασιασμό, την κινητικότητα, τη διαφοροποίηση και τη λειτουργία των κυττάρων στόχων που εμπλέκονται στο ανοσοποιητικό σύστημα. Παράγονται από ποικίλα κύτταρα σε απάντηση αντιγονικού ή φλεγμονώδους ερεθισμού και από διάφορα κύτταρα με αυτοκρινή, παρακρινή και σπανίως ενδοκρινή τρόπο. Η ανάγκη κατανόησης των αιτιών και των παθολογικών βάσεων του καρκίνου οδήγησαν στην προσπάθεια ανεύρεσης γενετικών μεταλλάξεων που ίσως διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη γενετική προδιάθεση καθώς και στην εμφάνιση και πρόοδο της νόσου. Οι μελέτες κατευθύνθηκαν στην ανεύρεση γονιδίων χαμηλής διείσδυσης που εμφανίζονται συχνά στο γονιδίωμα και συμμετέχουν στην προδιάθεση για καρκίνο σε σημαντικό αριθμό ασθενών. Τα τελευταία χρόνια, η έρευνα έχει εστιαστεί στη διερεύνηση των πολυμορφισμών των γονιδίων των κυτοκινών, ιδιαίτερα στην περιοχή του υποκινητή των γονιδίων που ενδεχομένως να επηρεάζει τη γονιδιακή μεταγραφή σε διαφορετικό βαθμό. Οι πολυμορφισμοί είναι κοινές κληρονομούμενες ποικιλομορφίες στην αλληλουχία του DNA που εμφανίζουν συχνότητα μεγαλύτερη του 1% στο γενικό πληθυσμό. Στο γονιδίωμα διακρίνουμε διάφορους τύπους πολυμορφισμών, τους μονονουκλεοτιδικούς πολυμορφισμούς (SNPs), τις ελλείψεις και τους διπλασιασμούς μιας μόνο βάσης. Η συχνότητα των πολυμορφικών αλληλίων μπορεί να ποικίλλει μεταξύ πληθυσμών και μέσα στον ίδιο τον πληθυσμό. Ο σκοπός της διατριβής αυτής είναι:•Η μελέτη συχνότητας χρωμοσωματικών ανωμαλιών σε ασθενείς με ΠΜ και η συσχέτιση με την επιβίωσή τους.•Η μελέτη μη τυχαίων χρωμοσωμικών ανωμαλιών σε ασθενείς με ΠΜ με φθορίζοντα in situ υβριδισμό (FISH)•H διερεύνηση ποικιλομορφιών του αριθμού αντιγράφων (CNVs) του γονιδιώματος σε ασθενείς με ΠΜ, με φυσιολογικό και παθολογικό καρυότυπο.•Σύγκριση αποτελεσμάτων των ανωτέρω τριών μεθοδολογιών όσον αφορά στην ευαισθησία ανίχνευσης γενετικών ανωμαλιών.•Η διερεύνηση μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών των γονιδίων των κυτοκινών IL-1A, IL-1B, IL-1RN σε ασθενείς με ΠΜ για την εκτίμηση της συμμετοχής τους ως προδιαθεσικών παραγόντων. Η μελέτη χωρίζεται σε δύο μέρη :Στο πρώτο μέρος παρουσιάζονται στοιχεία σχετικά με την εμφάνιση και την παθογένεια του Πολλαπλού Μυελώματος, τους γενετικούς και κυτταρογενετικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στις νεοπλασίες και ειδικότερα στο ΠΜ καθώς και τη διάγνωση, τη σταδιοποίηση και την πρόγνωση της νόσου. Τέλος αναλύεται ο ρόλος των κυτοκινών και των πολυμορφισμών των γονιδίων τους στην ανοσολογική απόκριση έναντι των νεοπλασιών.Στο δεύτερο μέρος περιγράφονται τα ακόλουθα :Οι ομάδες μελέτης: η μελέτη περιλαμβάνει 77 δείγματα ασθενών με ΠΜ. Η συλλογή και ο χαρακτηρισμός των δειγμάτων της μελέτης, πραγματοποιήθηκε στην Αιματολογική Κλινική του Γενικού Νοσοκομείου Λάρισας.Η κυτταρογενετική ανάλυση των δειγμάτων ΠΜ, μετά από κυτταρική καλλιέργεια.Η μοριακή κυτταρογενετική ανάλυση των δειγμάτων ΠΜ με την τεχνική του φθορίζοντα in situ υβριδισμού σε μεσοφασικούς πυρήνες. Η μοριακή ανάλυση των δειγμάτων ΠΜ με την τεχνική του γενωμικού συγκριτικού υβριδισμού (array CGH).Η μοριακή ανάλυση πολυμορφισμών των γονιδίων της ιντερλευκίνης 1, του υποδοχέα και του ανταγωνιστή της ιντερλευκίνης-1 και η μελέτη συχνότητάς τους σε φυσιολογικό πληθυσμό και σε ασθενείς με ΠΜ.Η στατιστική συσχέτιση των κυτταρογενετικών ευρημάτων με συμβατικό καρυότυπο και με τη μέθοδο FISH με την επιβίωση των ασθενών ΠΜ. Ο χρόνος μελέτης επιβίωσης ορίστηκε η 24μηνη διαβίωση από την διάγνωση.Στην παρούσα διατριβή ταυτοποιήθηκαν δύο μεγάλες ανευπλοειδικές ομάδες: η υπερδιπλοειδική ομάδα (47-75 χρωμοσώματα) και η μη-υπερδιπλοειδική ομάδα (30-45 χρωμοσώματα) που συμπεριλαμβάνει ψευδοδιπλοειδίες (46 χρωμοσώματα) και υποτετραπλοειδίες (75-90 χρωμοσώματα) και τους ασθενείς με μία επαναλαμβανόμενη δομική ανωμαλία που σχετίζεται με το ΠΜ όπως η μερική έλλειψη του χρωμοσώματος 13 ή οι μετατοπίσεις t(4;14) και t(11;14). H μοριακή κυτταρογενετική ανάλυση με την μέθοδο της FISH (φθορίζων in situ υβριδισμός) για την έλλειψη 13q14, τις μετατοπίσεις t(4;14), t(11;14) και t(14;16) και τις αναδιατάξεις 14q32 με άλλα χρωμοσώματα, οδήγησε στην ταυτοποίηση αυτών των ανωμαλιών τόσο σε ασθενείς με ΠΜ και εμφανείς χρωμοσωμικές ανωμαλίες, όσο και σε ασθενείς με φυσιολογικό καρυότυπο. Από τη στατιστική επεξεργασία των ευρημάτων, προέκυψε στατιστικά σημαντική διαφορά στην επιβίωση των ασθενών με παθολογικό καρυότυπο σε σύγκριση με τους ασθενείς με φυσιολογικό. Τα ποσοστά επιβίωσης μειώνονται σημαντικά σε ασθενείς που φέρουν τη έλλειψη 13q14 και ιδιαίτερα σε συνδυασμό με παθολογικό καρυότυπο, ενώ οι ανακατατάξεις του 14q32 και κυρίως η μετατόπιση t(4;14), επηρεάζουν δραστικά την επιβίωση των ασθενών, ιδιαίτερα σε συνδυασμό με υπερδιπλοειδία. Σε τρία δείγματα ασθενών με ΠΜ (ένας με φυσιολογικό καρυότυπο, ένας με παθολογικό καρυότυπο και εύρημα στη FISH και ένας με φυσιολογικό καρυότυπο και εύρημα στη FISH), πραγματοποιήθηκε ανάλυση με τη μέθοδο του Γενωμικού Συγκριτικού Υβριδισμού (array CGH) και επιβεβαιώθηκαν οι ανωτέρω ανωμαλίες και ανιχνεύθηκαν επιπλέον δομικές ανωμαλίες που αφορούσαν διπλασιασμούς και ελλείψεις, που δεν είχαν εντοπιστεί με συμβατικό καρυότυπο. Τέλος, από τη μελέτη κατανομής πολυμορφισμών των κυτοκινών σε 74 Έλληνες ασθενείς και 160 φυσιολογικούς μάρτυρες, βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ της συχνότητας μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών των ιντερλευκινών IL-1Α (θέση -889 C/T), IL-1Β (θέσεις -511 C/T, +3954 C/T), IL-1RN (θέση +11970 C/T και θέση +11100 C/T) και ΠΜ. Συμπερασματικά, από την παρούσα διατριβή προτείνεται ότι η τεχνική της συμβατικής κυτταρογενετικής είναι επαρκώς αποτελεσματική για την ανίχνευση παθολογικού κλώνου σε ασθενείς ΠΜ σταδίου ΙΙ και ΙΙΙ. Από την κυτταρογενετική ανάλυση των δειγμάτων προέκυψε πως η μη-υπερδιπλοειδής ομάδα ασθενών υπερισχύει αριθμητικά της υπερδιπλοειδούς σε αναλογία 3:1, παρουσιάζει δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες σε πολύ μεγαλύτερο ποσοστό και συνοδεύεται από χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης. Από τη μελέτη αυτή προέκυψε επαναλαμβανόμενη μη-τυχαία ολική ή μερική έλλειψη του χρωμοσώματος 13, σε μεγάλο ποσοστό των ασθενών, οδηγώντας στο συμπέρασμα πως αποτελεί αρχικό γενετικό γεγονός στην παθογένεση και εξέλιξη του ΠΜ. Η περαιτέρω εφαρμογή της τεχνικής FISH, αύξησε την ευαισθησία και ειδικότητα ανίχνευσης παθολογικών κλώνων και οδήγησε στο διπλασιασμό του αριθμού των ασθενών με ευρήματα. Επιπλέον, η εφαρμογή της FISH οδήγησε στο συμπέρασμα πως η έλλειψη του γενετικού 13q14 ή del (13q14) αποτελεί ισχυρή ανεξάρτητη προγνωστική παράμετρο, ενώ κακός προγνωστικός δείκτης αναδείχτηκε και η μετατόπιση t(4;14). Συνοπτικά, μετά από ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης, οι ασθενείς με χρωμοσωμικές ανωμαλίες εμφανίζουν 10 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο να μην επιβιώσουν κατά την περίοδο μελέτης, οι ασθενείς με del(13q14) 5 φορές και οι ασθενείς με αναδιατάξεις του 14q32 3 φορές. Η εφαρμογή array-CGH με μικροσυστοιχίες υψηλής ευκρίνειας σε 3 ασθενείς ανέδειξαν μοριακές αναδιατάξεις σε περιοχές που περιέχουν σημαντικά ογκογονίδια ή ογκοκατασταλτικά γονίδια, οι οποίες δεν είχαν εντοπιστεί με τις τεχνικές συμβατικού καρυότυπου και FISH, οδηγώντας στο συμπέρασμα πως η τεχνική θα μπορούσε να αποτελέσει διαγνωστικό εργαλείο ελέγχου ολόκληρου του γονιδιώματος. Τέλος, η μελέτη των πολυμορφισμών των γονιδίων των κυτοκινών έδειξε ότι οι γονότυποι IL-1A -889 CT, IL-1B -511 CT, IL-1B +3954 TT, IL-1RN +11970 TT και IL-1RN +11100 TT, αποκάλυψε συσχέτιση αυτών με το ΠΜ σε Έλληνες ασθενείς, η οποία υποδηλώνει την πιθανή εμπλοκή της φλεγμονώδους κυτοκίνης IL-1 στην προδιάθεση του ΠΜ.