Μηχανισμοί διεύρυνσης του φάσματος υποστρωμάτων των β- λακταμασών μοριακών τάξεων Α και C

Μελετήθηκαν οι επιδράσεις μεταλλάξεων στις θέσεις 104 και 170 που απαντούν στις φυσικές β-λακταμάσες τάξης Α τύπου GES (ήτοι Glu104Lys, Gly170Asn και Gly170Ser) καθώς και στη θέση 211 ενζύμων τάξης C τύπου CMY-2 (Val211Gly – CMY-30; Val211Ser – CMY-42). Η επίδραση της κάθε μετάλλαξης στην λειτουργία των ενζύμων προσδιορίστηκε με πειράματα ενζυμικής κινητικής στην κατάσταση ισορροπίας ενώ ο ρόλος αυτών κατά την αλληλεπίδραση με β-λακταμικά μόρια εξετάσθηκε με πειράματα αναστολής χρησιμοποιώντας βορονικά οξέα που έφεραν τις οξυίμινο πλευρικές αλυσίδες των κεφαλοσπορινών 3ης γενεάς. Επιπλέον προσδιορίστηκε ο ρόλος των μεταλλάξεων στη θερμική σταθερότητα των ενζύμων μέσω πειραμάτων αποδιάταξης. Οι δομικές αλλαγές που προκαλούνταν από την κάθε μετάλλαξη εκτιμήθηκαν με προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής ελεύθερων ενζύμων, ακύλ-ενζύμων κεφταζιδίμης και κεφοξιτίνης καθώς και συμπλόκων με το βορονικό ανάλογο της κεφταζιδίμης. Στα ένζυμα τύπου GES βρέθηκε ότι οι Gly170Asn και Gly170Ser αυξάνουν την υδρολυτική ικανότητα έναντι καρβαπενεμών, ενώ ένζυμα με σερίνη στην συγκεκριμένη θέση υδρέλυαν και την κεφοξιτίνη. Η Glu104Lys διεύρυνε το φάσμα υποστρωμάτων προς τις οξυίμινο κεφαλοσπορίνες. Η δομική ανάλυση έδειξε ότι οι Gly170Asn και Gly170Ser προκαλούσαν ισχυροποίηση του δικτύου αλληλεπιδράσεων των αμινοξέων της καταλυτικής μηχανής. Προτάθηκε ότι η υδρόλυση καρβαπενεμών από τα ένζυμα τύπου GES είναι ανάλογη της ισχύος των αλληλεπιδράσεων των καταλυτικών αμινοξέων Glu166, Lys73 και Ser70. Τα ένζυμα με Lys στη θέση 104 είχαν υψηλότερη συγγένεια για τις αρνητικά φορτισμένες οξυίμινο πλευρικές αλυσίδες. Η αυξημένη υδρόλυση οξυίμινο κεφαλοσπορινών πιθανότατα οφείλεται σε επιπλέον φαινόμενα καθώς εργαστηριακοί μεταλλάκτες της θέσης 104 που έφεραν μη πολικά αμινοξέα παρουσίαζαν επίσης έντονο χαρακτήρα εκτεταμένου φάσματος. Οι Val211Gly και Val211Ser στη CMY-2 οδηγούσαν σε αυξημένη υδρόλυση οξυίμινο β-λακταμικών. Το παραπάνω συνδυάζονταν με μειωμένη συγγένεια έναντι των οξυίμινο πλευρικών αλυσιδών και με μειωμένη θερμική σταθερότητα απουσία και παρουσία των παραπάνω προσδετών. Οι προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής έδειξαν ότι τα ένζυμα εκτεταμένου φάσματος ήταν περισσότερο ευέλικτα επιτρέποντας την εμφάνιση διαμορφώσεων των ριζών ακυλ-ενζύμου της κεφταζιδίμης που ομοίαζαν δομικά με την κατάσταση μετάπτωσης της απακυλίωσης με υψηλότερη συχνότητα σε σύγκριση με τη CMY-2. Επίσης η επίθεση του υδρολυτικού νερού στη β-επιφάνεια του εστερικού δεσμού ήταν λιγότερο παρεμποδισμένη.