In vitro παραγωγή εμβρύων βοοειδών σε υποστρώματα τροποποιημένα με γουαϊαζουλένιο ή γκρελίνη

Σκοπός της διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος αντιοξειδωτικών ουσιών σε όλα τα στάδια της εξωσωματικής παραγωγής εμβρύων βοοειδών, και να αποτυπωθεί ο ρόλος τους στην ποσοτική απόδοση σε έμβρυα και στην ποιότητα τους, με εκτίμηση συγκεκριμένων γονιδιακών δεικτών. Σε περιβάλλον που δεν προάγει την ανάπτυξη οξειδωτικών φαινομένων (χαμηλή συγκέντρωση οξυγόνου), μελετήθηκαν δύο αντιοξειδωτικές ουσίες, μια εξωγενής – το γουαϊαζουλένιο και μία ενδογενής , η γκρελίνη. Ωάρια σφαγίων αγελάδων ωρίμαζαν για 24 ώρες σε TCM199 εμπλουτισμένο με ορό εμβρύου μόσχου και επιδερμικό αυξητικό παράγοντα, στη συνέχεια γονιμοποιούνταν, οι γαμέτες συνεπωάζονταν για άλλες 24 ώρες και τέλος οι ζυγώτες καλλιεργούνταν σε ομάδες των 25 σε συνθετικό υγρό ωαγωγού. Βλαστοκύστεις της ημέρας 7 καταψύχονταν για ποσοτικό προσδιορισμό (qRT-PCR) του mRNA γονιδίων, που σχετίζονται με την οξείδωση, το μεταβολισμό, τη δυνατότητα εμφύτευσης του εμβρύου, την απόπτωση. Προσθήκη γουαϊαζουλένιου σε συγκεντρώσεις 0.1 mM και 0.01mM στην IVM ή στην IVC δεν επηρέασε το ποσοστό παραγωγής εμβρύων ούτε διαφοροποίησε την έκφραση 7 γονιδίων που μελετήθηκαν. Προσθήκη γκρελίνης σε συγκεντρώσεις• 200 pg/ml, 800 pg/ml και 2000pg/ml, στο υπόστρωμα ωρίμανσης μείωσε σημαντικά το ποσοστό παραγωγής βλαστοκύστεων. Με σύμπτυξη του χρόνου ωρίμανσης στις 18 ώρες βρέθηκε ότι σε σύγκριση με τους αντίστοιχους μάρτυρες, περισσότερα ωάρια που καλλιεργήθηκαν για 18 ώρες με την παρουσία γκρελίνης έφτασαν στην μετάφαση ΙΙ, ενώ δεν ανιχνεύθηκαν διαφορές για τις ομάδες στις οποίες η ωρίμανση διήρκεσε 24 ώρες. Στις 18 και 24 ώρες, η στιβάδα των κοκκωδών κυττάρων ήταν περισσότερο διατεταμένη στα COCs που ωρίμασαν υπό την παρουσία γκρελίνης. To ποσοστό σχηματισμού βλαστοκύστεων ήταν μεγαλύτερο μετά από ωρίμανση των ωαρίων για 18 ώρες, σε σχέση με αυτό των 24. Διαφορές εντοπίστηκαν σε διάφορες γονιδιακές εκφράσεις, οι οποίες οδηγούν στην εκτίμηση ότι η παρουσία της γκρελίνης για 24 ώρες οδηγεί στην υπερ-ωρίμανση / γήρανση των ωαρίων. Όμως, τα υψηλά ποσοστά εκκόλαψης των βλαστοκύστεων που αναπτύχθηκαν από ωάρια, τα οποία εκτέθηκαν σε γκρελίνη, δείχνουν ότι οι τελευταίες είναι καλύτερης ποιότητας από αυτές των ομάδων των μαρτύρων. Η παρουσία γκρελίνης στο υπόστρωμα καλλιέργειας των εμβρύων μείωσε σημαντικά το ποσοστό παραγωγής βλαστοκύστεων. Όμως η καθημερινή ανανέωση του υποστρώματος αύξησε σημαντικά το ποσοστό των παραγόμενων εμβρύων. Διαφορές ανιχνεύθηκαν στην έκφραση των γονιδίων, που οδηγούν στην εκτίμηση ότι η γκρελίνη βελτίωσε την ποιότητα των εμβρύων. Συνάγεται ότι η δράση της γκρελίνης, αφορά τόσο επιτάχυνση της διαδικασίας ωρίμανσης των ωαρίων, αλλά και σε επίπεδο ανάπτυξης του πρώιμου εμβρύου. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής δείχνουν ότι όταν οι συνθήκες παραγωγής δεν ευνοούν την οξείδωση, το οξειδωτικό στρες δεν είναι μείζον πρόβλημα για την εξωσωματική παραγωγή εμβρύων. Αντιθέτως, ενδογενείς αντιοξειδωτικές ουσίες –όπως η γκρελίνη- είναι δυνατό να επηρεάσουν την διαδικασία της παραγωγής και την ποιότητα των εμβρύων μέσω πολλαπλών λειτουργικών οδών, που σχετίζονται με το μεταβολισμό, τη δυνατότητα ανάπτυξης, την απόπτωση, τη μεθυλίωση ή και την οξείδωση.