Πρωτεϊνική μηχανική του ενζύμου μεταφοράση της γλουταθειόνης με στόχο την ανάπτυξη βιοαισθητήρα μέτρησης ξενοβιοτικών ενώσεων

Οι μεταφοράσες της γλουταθειόνης (glutathione S-transferases, GSTs, EC 2.5.1.8), είναι πολυλειτουργικά ένζυμα, που καταλύουν την πυρηνόφιλη προσβολή της σουλφυδρυλικής ομάδας του τριπεπτιδίου της γλουταθειόνης (GSH) στο ηλεκτρονιόφιλο κέντρο ενδογενών και ξενοβιοτικών ενώσεων (π.χ. φαρμάκων, φυτοπροστατευτικών προϊόντων), σχηματίζοντας υδατοδιαλυτά σύμπλοκα. Τα σύμπλοκα αυτά, απεκκρίνονται εύκολα από το κύτταρο. Οι GSTs απαντούν στα θηλαστικά, στα φυτά, στα έντομα, στους μύκητες και στα βακτήρια. Παρουσιάζουν ακόμα δράση υπεροξειδάσης, ισομεράσης, διϋδροασκορβικής ρεδουκτάσης. Τέλος, λειτουργούν και ως μεταφορείς υδρόφοβων μορίων για τη μεταφορά και αποθήκευση τους, μέσα στο κύτταρο. Η δομική τους ευελιξία είναι αυτή που επιτρέπει και τη διαφοροποίηση της καταλυτικής τους δράσης. Συνολικά ο σκοπός της παρούσας διατριβής, ήταν η εύρεση ενζύμων GSTs που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν, για την ανάπτυξη απλών αναλυτικών μεθόδων με δυνατότητα κατασκευής βιοαισθητήρα, για τον προσδιορισμό φυτοπροστατευτικών προϊόντων σε δείγματα κυρίως περιβαλλοντικά, αλλά και βιολογικά. Η αναγκαιότητα τέτοιου είδους ερευνών είναι αδιαμφισβήτητη, λόγω της αλόγιστης χρήσης φυτοπροστατευτικών προϊόντων, της υπολειμματικότητας που εμφανίζουν και της τοξικότητας τους στα οικοσυστήματα. Η έρευνα αυτή χωρίστηκε σε τρείς επιμέρους, όπου στη πρώτη (Κεφάλαιο 3), μελετήθηκαν GSTs από τον άνθρωπο, ενώ οι άλλες δύο (Κεφάλαιο 4 και 5) αφορούσαν σε φυτικές GSTs.Στην πρώτη μελέτη, μελετήθηκαν ισοένζυμα από τον άνθρωπο, ως προς τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Αφού λοιπόν πρώτα εκφράστηκαν τα ισοένζυμα hGSTP1*A, hGSTP1*B, hGSTP1*C, hGSTA1-1, hGSTT2-2 και hGSTO1-1, καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας, ακολούθησε σάρωση ως προς μεγάλη ποικιλία ζιζανιοκτόνων και εντομοκτόνων. Από τις μετρήσεις προέκυψε ότι, το hGSTA1-1 φαίνεται να αναστέλλεται περισσότερο, παρουσιάζοντας τη μεγαλύτερη αναστολή της δραστικότητας (>95%) με τα εντομοκτόνα dieldrin και spiromesifen, ενώ οι μικρότερες τιμές IC50 παρατηρήθηκαν στους 370C και σε pH 6,5, οι οποίες ήταν 17,9 ± 1,7 μΜ και 12,1 ± 3,4 μΜ αντίστοιχα. Οι ενώσεις αυτές αλληλεπιδρούν με το ένζυμο, στην περιοχή δέσμευσης των υποστρωμάτων (G- και H-περιοχή) του ενεργού κέντρου και συμπεριφέρονται σαν αναστολείς μικτού-τύπου (Ki 2,3±0.1 και 0,1±0,01 μΜ, έναντι GSH και CDNB, αντίστοιχα). Οι πρότυπες καμπύλες οι οποίες σχεδιάστηκαν (σταθερή απόκλιση 4,1%), με γνωστές συγκεντρώσεις των δύο εντομοκτόνων, επιτρέπουν τον ακριβή ποσοτικό προσδιορισμό τους σε δείγματα νερού, με αποτελέσματα συγκρίσιμα της HPLC μεθόδου. Από την παρούσα μελέτη φαίνεται ότι το ισοένζυμο hGSTA1-1, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη νέων απλών μεθόδων αναλυτικού προσδιορισμού φυτοπροστατευτικών με ικανοποιητική ακρίβεια, συνδυάζοντας χαμηλό κόστος και ελάχιστη προετοιμασία δείγματος. Οι μεταφοράσες της γλουταθειόνης (GSTs) που απαντούν στα φυτά, αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια από ισοένζυμα, τα οποία παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση συνθηκών καταπόνησης και στην αποτοξίνωση ξενοβιοτικών. Τέσσερα GST ισοένζυμα από φύλλα του φυτού P.vulgaris, αλληλουχήθηκαν και η ανάλυση των cDNA έδειξε υψηλή ομολογία με GSTs των τάξεων τ (tau) και φ (phi). Στη συνέχεια εκφράστηκαν σε E. coli και καθαρίστηκαν με χρωματογραφία συγγένειας. Ακολούθησε προσδιορισμός της ειδικής δραστικότητας των ισοενζύμων έναντι 20 διαφορετικών υποστρωμάτων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ισοένζυμα GSTs καταλύουν μεγάλο εύρος αντιδράσεων και επιδεικνύουν ευρεία εκλεκτικότητα. Πραγματοποιήθηκε μοριακή μοντελοποίηση και ανάλυση της δομής, ώστε να αναγνωριστούν τα δομικά χαρακτηριστικά, να κατανοηθεί η εξειδίκευση υποστρώματος και ο καταλυτικός μηχανισμός αυτών των ενζύμων. Τα αποτελέσματα αυτά έδωσαν νέα στοιχεία σχετικά με την καταλυτική και δομική ετερογένεια των GSTs του P. vulgaris.Η μελέτη δραστικότητας φανέρωσε την ποικιλομορφία που χαρακτηρίζει αυτά τα ισοένζυμα, ως προς την εξειδίκευσή τους. Για το κάθε ισοένζυμο υπήρξε διαφορετικό καλύτερο υπόστρωμα, με τα ισοένζυμα PvGSTU1-1, PvGSTU2-2, PvGSTU3-3 και PvGSTF1-1, να παρουσιάζουν μεγαλύτερη δραστικότητα, ως προς τα υποστρώματα ισοθειοκυανικό αλλυλ-εστέρα, 4-χλωρο-7-νιτροβενζο-2-οξο-1,3-διαζόλιο, 1-χλώρο-2,4-δινιτροβενζόλιο και 2,2 διθειοδιαιθανόλη, αντίστοιχα. Δομικές αναλύσεις έδειξαν ότι οι PvGSTs μοιράζονται ίδια χαρακτηριστικά με άλλες κυτταροπλασματικές φυτικές GSTs, με διαφορές στο ενεργό τους κέντρο και στη C-τελική περιοχή, καθώς και στον σύνδεσμο των N- και C- τελικών περιοχών. Η ετερογένεια που παρατηρήθηκε στη C-τελική περιοχή, φαίνεται να είναι υπεύθυνη για την διαφορετική εξειδίκευση στις PvGSTs. Τα παραπάνω ισοένζυμα όμως που μελετήθηκαν, δεν έδειξαν ικανοποιητική ευαισθησία αναστολής, ως προς φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Έτσι, έχοντας ως σκοπό την ανάπτυξη βιοαισθητήρα ανίχνευσης και προσδιορισμού φυτοπροστατευτικών προϊόντων, αποφασίστηκε η εφαρμογή μεθόδων πρωτεϊνικής μηχανικής, ώστε να διευρυνθεί η δυνατότητα ευρέσεως νέων ενζύμων GSTs, με ικανοποιητική ευαισθησία ως προς τα φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Για το σκοπό αυτό καταπονήθηκαν φυτά P.vulgaris και G.max, θέλοντας να επαχθεί η έκφραση των GSTs, απομονώθηκε RNA με σκοπό τη δημιουργία cDNA βιβλιοθήκης. Χρησιμοποιώντας κατάλληλους εκφυλισμένους εκκινητές και PCR, απομονώθηκαν GST γονίδια από φύλα, βλαστό και ρίζα. Τα GST γονίδια υποβλήθηκαν σε in vitro κατευθυνόμενη εξέλιξη (DNA shuffling). H βιβλιοθήκη νέων GST γονιδίων που προέκυψε, κλωνοποιήθηκε σε φορέα κατάλληλο για έκφραση σε E. coli. Σάρωση της βιβλιοθήκης, οδήγησε στην επιλογή μιας νέας μορφής GST ενζύμου, που ανήκει στην τ τάξη. Το νέο αυτό ένζυμο (PvGmGSTUG) καθαρίστηκε με χρωματογραφία συγγένειας και μελετήθηκε κινητικά. Επίσης ελέγχθηκε η εκλεκτικότητά του, ως προς 20 υποστρώματα και 66 φυτοπροστατευτικά προϊόντα. Το ένζυμο αυτό εμφανίζει υψηλή δράση μεταφοράσης και υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης. Μελετώντας τα διαφορετικά φυτοπροστατευτικά προϊόντα, βρέθηκαν κυρίως τα οργανοχλωριωμένα εντομοκτόνα και οι στρομπιλουρίνες (μυκητοκτόνα), να είναι ισχυροί αναστολείς του ενζύμου. Η ευαισθησία του ενζύμου ως προς τα φυτοπροστατευτικά βελτιώθηκε περαιτέρω, εφαρμόζοντας κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση κορεσμού στη θέση Phe117 της αμινοξικής αλληλουχίας. Τελικά προέκυψαν επτά νέες μεταλλαγμένες μορφές, οι οποίες σε γενικές γραμμές διατήρησαν παρόμοια κινητική συμπεριφορά με αυτόν του ενζύμου PvGmGSTUG, παρουσιάζοντας όμως βελτίωση ως προς τη συγγένεια του με τη GSH. Η μορφή Phe117Ile εμφάνισε 5-φορές υψηλότερη καταλυτική αποτελεσματικότητα και μεγαλύτερη ευαισθησία έναντι της ομάδας των οργανοχλωριωμένων εντομοκτόνων. Συνεπώς, η μορφή Phe117Ile χρησιμοποιήθηκε για την μελέτη κατασκευής οπτικού βιοαισθητήρα. Το ένζυμο ακινητοποιήθηκε σε σύστημα sol-gel αλκοξυσιλανίων (TEOS/PTMOS), το ίδιο και οι δείκτες pH bromocresol purple (όξινος) και phenol red (βασικός). Έτσι με σύστημα δύο διαφορετικών εγκλωβισμών, αναπτύχθηκε αναλυτική μέθοδος προσδιορισμού του ισομερούς α-endosulfan. To σύστημα εμφανίζει γραμμικότητα στην περιοχή pH=4-7 στα 562 nm. Πρότυπη καμπύλη για το α-endosulfan σχεδιάστηκε σε εύρος συγκέντρωσης 0-30 μM.