Ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τον αυξητικό παράγοντα πλειοτροπίνη και διερεύνηση του λειτουργικού τους ρόλου

Η πλειοτροπίνη (PTN) αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη όγκων και την αγγειογένεση. Διάφοροι υποδοχείς αλληλεπιδρούν με την ΡΤΝ και διαμεσολαβούν τις βιολογικές της δράσεις, όπως η Ν-συνδεκάνη, ο ALK (κινάση αναπλαστικού λεμφώματος) και ο RPTPβ/ζ (υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ). Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η ικανότητα της PTN να επάγει κυτταρική μετανάστευση εξαρτάται από το σχηματισμό ενός λειτουργικού συμπλόκου που αποτελείται από τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη ανβ3. Η πολυ-λειτουργική πρωτεΐνη νουκλεολίνη (NCL), η οποία υπερεκφράζεται στην επιφάνεια ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων και διαμεσολαβεί τις διεγερτικές δράσεις διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων, έχει επίσης προταθεί ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας για την ΡΤΝ, με άγνωστες όμως λειτουργίες. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε, με τη χρήση μεθόδων ανοσοκατακρήμνισης-ανοσοαποτυπώματος, διπλού ανοσοφθορισμού και προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας, ότι η PTN αλληλεπιδρά άμεσα με τη NCL. Η αλληλεπίδραση αυτή περιλαμβάνει πρόσδεση της αμινοτελικής περιοχής της ΡΤΝ (αμινοξέα: 16-24) στην κεντρική περιοχή της NCL (αμινοξέα: 308-645). Μείωση της έκφρασης της NCL με siRNA ή λειτουργική αναστολή της μεμβρανικής NCL από το πεπτίδιο 5(KPR)TASP ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Με αφετηρία την παρατήρηση ότι ο εντοπισμός της NCL στην κυτταρική επιφάνεια ανιχνεύθηκε μόνο σε κύτταρα που εκφράζουν την ανβ3, και πραγματοποιώντας πειράματα ανοσοφθορισμού και βιοχημικές μελέτες σε κύτταρα με γενετικά τροποποιημένη έκφραση των υπό μελέτη μορίων, δείξαμε ότι ο εντοπισμός της NCL στην πλασματική μεμβράνη εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της c-src. Καθοδικά της ανβ3, η PI3K συμμετέχει σε αυτή τη δράση. Ο VEGF165 που επίσης επάγει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL, δρα μέσω δέσμευσης στον RPTPβ/ζ και ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3. Η περιοχή δέσμευσης στους υποδοχείς VEGFR-1 και VEGFR-2 ή η περιοχή δέσμευσης στην ηπαρίνη στο μόριο του VEGF165 δεν εμπλέκονται στον επαγόμενο από VEGF165 εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη. Εκτός από την PI3K, στη δράση του VEGF165 καθοδικά της ανβ3 εμπλέκεται και η κινάση p38, η ενεργοποίηση της οποίας είναι ανεξάρτητη από τον RPTPβ/ζ και τη φωσφορυλίωση της β3 στις τυροσίνες 773 ή 785, και φαίνεται να ανήκει σε μονοπάτι που ενεργοποιείται παράλληλα και που παραμένει αδιευκρίνιστο. Μηχανιστικά, η NCL βρέθηκε να αλληλεπιδρά άμεσα με την ανβ3, τον RPTPβ/ζ, τον VEGF165 και τον VEGFR-2, αλλά επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό μόνο του RPTPβ/ζ και της PTN. Θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση της μεμβρανικής NCL και της ανβ3 σε μικροσυστοιχίες ιστών προερχόμενων από ανθρώπινα γλοιοβλαστώματα. Τέλος, βρέθηκε ότι το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-C23 και τα πεπτίδια που στοχεύουν τη μεμβρανική NCL, 5(KPR)TASP, ΗΒ-19 και Nucant 6L, ανέστειλλαν σημαντικά τη μετανάστευση κυττάρων που εκφράζουν ανβ3, ενώ είχαν μικρή ή καθόλου δράση στη μετανάστευση κυττάρων που δεν εκφράζουν ανβ3 ή υπερεκφράζουν μετάλλαγμα της β3 με αντικατάσταση της κυτταροπλασματικής τυροσίνης 773 σε φαινυλαλανίνη. Συνολικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι η έκφραση της ανβ3 και η φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 καθορίζουν τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, καθοδικά του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src που συμμετέχει στην κυτταρική μετανάστευση που επάγεται τόσο από την ΡΤΝ, όσο και από τον VEGF165. Επίσης, φαίνεται ότι η έκφραση της ανβ3 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης για τη χρήση ανταγωνιστών της μεμβρανικής NCL ως αντικαρκινικών παραγόντων.