Κινητική μελέτη της αλκοολικής ζύμωσης παρουσία νέων βιοκαταλυτών

Η Αέρια Χρωματογραφία Αναστρεφόμενης Ροής (Α.Χ.Α.Ρ.)χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των σταθερών ταχύτητας σε κάθεφάση της αλκοολικής ζύμωσης καθώς και της παραγόμενης αλκοόλης(αιθανόλης), παρουσία νέων βιοκαταλυτών. Οι σταθερές ταχύτητας σε κάθεφάση της αλκοολικής ζύμωσης προσδιορίστηκαν με την εξαγωγή ενόςμαθηματικού μοντέλου το οποίο συνδέει τα πειραματικά μετρούμενα μεγέθη(ύψος κορυφών έκλουσης) με τη συγκέντρωση της παραγόμενης αιθανόλης.Η τεχνική της Α.Χ.Α.Ρ. στηρίζεται στην απλή ή διπλή αναστροφή της ροήςτου φέροντος αερίου ανά τακτά χρονικά διαστήματα και επιτρέπει τονπροσδιορισμό φυσικοχημικών μεγεθών. Έχει εφαρμοστεί με επιτυχία στονπροσδιορισμό των συντελεστών διάχυσης και μεταφοράς μάζας, τωνσταθερών ισορροπίας προσρόφησης, των παραμέτρων Lennard-Jones,καθώς και στον προσδιορισμό σταθερών ταχύτητας, κ.α.Στην παρούσα διατριβή το είδος της ζύμης που χρησιμοποιήθηκε ήταντο ψυχρόφιλο και αλκοολοανθεκτικό στέλεχος, Saccharomyces cerevisiaeAXAZ-1, το οποίο απομονώθηκε από μια Ελληνική αγροτική περιοχή καιφυλάσσεται στο Εργαστήριο Τεχνολογίας Τροφίμων του Τμήματος Χημείαςτου Πανεπιστημίου Πατρών. @ς φορέας ακινητοποίησης χρησιμοποιήθηκε,για πρώτη φορά το άμυλο σε διαφορετικές μορφές: πρώτες ύλες από τιςοποίες προέρχεται το άμυλο (σιτάρι, κριθάρι, αραβόσιτος, πατάτα, ρύζι),ζελατινοποιημένο άμυλο (σιτάρι, αραβόσιτος), καθώς και καθαρό άμυλο(σιτάρι, αραβόσιτος).Επιπλέον, με σκοπό την πιστοποίηση της ακρίβειας τόσο τουμαθηματικού μοντέλου όσο και της τεχνικής της Α.Χ.Α.Ρ. για τη μέτρηση τηςπαραγόμενης αιθανόλης, πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις με δύο επιπλέονμεθόδους: την κλασσική χρωματογραφία και την απόσταξη και έγινεσύγκριση των αποτελεσμάτων. Η ακινητοποίηση των κυττάρων της ζύμηςστους φορείς επιβεβαιώθηκε με φωτογραφίες όπως αυτές ελήφθησαν με τοηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. Οι επαναλαμβανόμενες αλκοολικέςζυμώσεις, που πραγματοποιήθηκαν σε θρεπτικό γλυκόζης, και εν συνεχεία σε μούστο, απέδειξαν ότι τα ακινητοποιημένα κυτταρικά συστήματαοδήγησαν σε μικρότερους χρόνους ζύμωσης συγκριτικά με τα ελεύθερα.Κατά την κινητική μελέτη των αλκοολικών ζυμώσεων καλύτεροι φορείςακινητοποίησης στην κατηγορία των πρώτων υλών ήταν το σιτάρι, ενώ σεαυτήν του ζελατινοποιημένου αμύλου ο αραβόσιτος, καθώς παρουσίασανυψηλότερες τιμές σταθερών ταχύτητας έναντι των υπολοίπων φορέων, όπωςυπολογίστηκαν με την Α.Χ.Α.Ρ. για κάθε φάση της αλκοολικής ζύμωσης.Αξίζει να σημειωθεί πως οι σταθερές ταχύτητας που υπολογίστηκαν για τηδεύτερη φάση της αλκοολικής ζύμωσης είναι μιας τάξης μεγέθουςμικρότερες σε σχέση με εκείνες που εμφανίζονται στις άλλες δύο φάσεις. Σεόλες τις περιπτώσεις δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα ποσά τηςπαραγόμενης αιθανόλης που προσδιορίστηκαν στο τέλος των αλκοολικώνζυμώσεων είτε με την Α.Χ.Α.Ρ., είτε με τις μεθόδους της κλασσικήςχρωματογραφίας και της απόσταξης. Από τα παραπάνω συμπεραίνουμε, πωςη Α.Χ.Α.Ρ. παρέχει αξιόπιστα αποτελέσματα συγκριτικά με τις άλλες δύομεθόδους και επιτρέπει τον ταυτόχρονο προσδιορισμό των σταθερώνταχύτητας σε κάθε φάση της αλκοολικής ζύμωσης καθώς και τηςπαραγόμενης αιθανόλης. Επιπλέον, προσδιορίστηκαν οι σταθερές ταχύτηταςγια κάθε φάση των αλκοολικών ζυμώσεων που πραγματοποιήθηκαν σεβιοαντιδραστήρα 100 L χρησιμοποιώντας τον βέλτιστο βιοκαταλύτη(σταθερότητα δραστικότητας του βιοκαταλύτη, σταθερές ταχύτητας για κάθεφάση της ζύμωσης) από την κατηγορία των πρώτων υλών, το σιτάρι.Ένας από τους κύριους σκοπούς της παρούσας διατριβής ήταν ημελέτη της κινητικής των αλκοολικών ζυμώσεων των ελεύθερων καιακινητοποιημένων κυττάρων ΑΧΑΖ-1 σε καθαρό άμυλο (σιτάρι, αραβόσιτος),σε διαφορετικές τιμές θερμοκρασίας και pH, μέσω της ΜονοφασικήςΧρωματογραφίας Βαρυτικού Πεδίου (Μ.Χ.Β.Π.) και η σύγκριση τωναποτελεσμάτων με τα αντίστοιχα που ελήφθησαν με την Α.Χ.Α.Ρ. Η μέθοδοςαυτή (Μ.Χ.Β.Π.) είναι κατάλληλη για τoν χαρακτηρισμό των κυττάρων τωνζυμών και τη μελέτη της βιωσιμότητας και της δραστικότητάς τους.Iιαφορές που εμφανίζονται στις καμπύλες έκλουσης σχετίζονται άμεσα μετις διαφορετικές κατανομές των κυττάρων της ζύμης, τις διαφορετικέςπυκνότητες, τη μορφολογία και/ή το μέγεθός τους. Η Μ.Χ.Β.Π. μπορεί να μας δώσει πολύτιμες πληροφορίες για την κατανομή του μεγέθους τωνκυττάρων της ζύμης, την πυκνότητα και το μέγεθός τους. Για νααποδείξουμε τη σχέση μεταξύ των μεταβολών που παρατηρούνται στιςκορυφές έκλουσης με την κινητική των αλκοολικών ζυμώσεων,πραγματοποιήθηκαν επιπλέον αναλύσεις για τον υπολογισμό της τελικήςσυγκέντρωσης σακχάρου με Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης(H.P.L.C.) καθώς και της % v/v συγκέντρωσης της αιθανόλης με κλασσικήΑέρια Χρωματογραφία (G.C.). Τόσο τα ακινητοποιημένα όσο και ταελεύθερα συστήματα λειτούργησαν καλύτερα στη θερμοκρασία των 30ºCπαρουσιάζοντας τις υψηλότερες τιμές σταθερών ταχύτητας. Η μείωση τηςθερμοκρασίας οδήγησε σε μείωση των σταθερών ταχύτητας της ζύμωσηςκαθώς και του αριθμού των ακινητοποιημένων κυττάρων. Επιπλέον, στο pHτου θρεπτικού υγρού (pH=5), παρατηρήθηκαν υψηλότερες ταχύτητεςζύμωσης καθώς και μεγαλύτερα ποσοστά παραγωγής αιθανόλης. Η διάρκειατων αλκοολικών ζυμώσεων καθώς και οι σταθερές ταχύτητας αυτώνπαρουσίασαν μικρότερες τιμές στα ακινητοποιημένα κύτταρα, συγκριτικά μετα ελεύθερα, γεγονός που συμφωνεί με τη βιβλιογραφία. Τέλος,συγκρίνοντας τα συστήματα των ακινητοποιημένων κυττάρων καλύτεροιχρόνοι ζύμωσης και υψηλότερες τιμές σταθερών ταχύτητας, παρατηρήθηκανόταν σαν φορέας χρησιμοποιήθηκε άμυλο από σιτάρι. Επιπλέον,διαπιστώνουμε πως οι ενέργειες ενεργοποίησης των αλκοολικών ζυμώσεωνεμφανίζουν μικρότερες τιμές παρουσία των φορέων ακινητοποίησης σε κάθετιμή pH. Τα ανωτέρω επιβεβαιώνουν την καταλυτική ικανότητα και των δύοφορέων ακινητοποίησης με το σιτάρι να πλεονεκτεί έναντι του αραβόσιτου.Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από την κινητική μελέτη τωναλκοολικών ζυμώσεων με τις τεχνικές της Α.Χ.Α.Ρ. και της Μ.Χ.Β.Π.οδήγησαν σε σύγκριση των δύο μεθόδων και επιβεβαίωση της ακρίβειας καιαξιοπιστίας τους.