Νέες τεχνικές ανάλυσης ειδικών αλληλουχιών DNA και RNA

Οι μέθοδοι ανίχνευσης και προσδιορισμού ειδικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων βασίζονται στην υβριδοποίηση (μοριακή αναγνώριση) του αναλύτη με συμπληρωματικό μόριο DNA/RNA, το οποίο είναι συνδεδεμένο, άμεσα ή έμμεσα, με κατάλληλο ιχνηθέτη για παραγωγή σήματος. Το φάσμα εφαρμογών των μεθόδων υβριδοποίησης συνεχώς διευρύνεται, κυρίως ως αποτέλεσμα της προόδου των προγραμμάτων προσδιορισμού της αλληλουχίας του γονιδιώματος του ανθρώπου και άλλων οργανισμών. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι αφενός η ανάπτυξη μεθόδων υβριδοποίησης που παρέχουν τη δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισμού πολλών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων και αφετέρου η απλοποίηση των μεθόδων υβριδοποίησης με τη χρήση βιοαισθητήρα DNA. Στο Κεφάλαιο 1 της διατριβής περιγράφεται η αρχή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) και η αντίστροφη μεταγραφή-PCR (RT-PCR) ως οι πιο σημαντικές τεχνικές εκθετικού πολλαπλασιασμού ειδικών αλληλουχιών DNA και RNA, οι οποίες αποτελούν αναπόσπαστο μέρος κάθε σύγχρονης μεθόδου ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων. Παρουσιάζεται επίσης η τεχνική της ποσοτικής PCR και διάφορες μέθοδοι προσδιορισμού των προϊόντων της PCR. Στο Κεφάλαιο 2 γίνεται παρουσίαση των δοκιμασιών υβριδοποίησης νουκλεϊκών οξέων, οι οποίες αποτελούν και τον ακρογωνιαίο λίθο της αναλυτικής χημείας του DNA και RNA. Περιγράφεται η εξέλιξη των ιχνηθετών από τα ραδιοϊσότοπα μέχρι τους πιο σύγχρονους μη ραδιενεργούς ιχνηθέτες που παρέχουν υψηλή ανιχνευσιμότητα και δυνατότητες αυτοματοποίησης. Παρουσιάζονται οι ομογενείς και ετερογενείς δοκιμασίες υβριδοποίησης και διάφορες παραλλαγές που διευκολύνουν την εκτέλεση τους. Στο Κεφάλαιο 3 παρέχεται σύντομη περιγραφή της αρχής λειτουργίας και της οργανολογίας της κυτταρομετρίας ροής, η οποία αποτελεί ένα ισχυρό αναλυτικό εργαλείο για τη διερεύνηση ιδιοτήτων μικροσωματιδίων (π.χ. κυττάρων αλλά και συνθετικών μικροσφαιριδίων). Αντικείμενο του Κεφαλαίου 4 είναι η ανάπτυξη πολλαπλών φθορισμομετρικών δοκιμασιών υβριδοποίησης DNA και RNA σε εναιώρημα φασματικά διακριτών μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου. Κάθε μικροσφαιρίδιο περιέχει δύο φθορίζουσες χρωστικές σε συγκεκριμένη αναλογία και με αυτό τον τρόπο έχει καταστεί ένα φασματικά κωδικοποιημένο στερεό υπόστρωμα για την εκτέλεση δοκιμασιών υβριδοποίησης. Ειδικά ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές προσδένονται ομοιοπολικά στην επιφάνεια κάθε μικροσφαιριδίου. Η αλληλουχία του DNA- ή RNA-στόχου (αναλύτης) υβριδοποιείται με τα ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια και τα υβρίδια ποσοτικοποιούνται με άλλη φθορίζουσα ουσία. Το εναιώρημα αναλύεται με κυτταρομετρητή ροής με ανιχνευτή φθορισμού επαγώμενου με δύο πηγές λέιζερ. Μελετήθηκε ο προσδιορισμός μονόκλωνου DNA, δίκλωνου DNA και RNA και πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης σε ασθενείς με λευχαιμία. Στο Κεφάλαιο 5 παρουσιάζεται ο πρώτος βιοαισθητήρας DNA τύπου εμβαπτιζόμενης ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση 7 χρωμοσωμικών αλληλομεταθέσεων, οι οποίες σχετίζονται άμεσα με την οξεία ή τη χρόνια λευχαιμία. Ο βιοαισθητήρας βασίζεται σε ολιγονουκλεοτίδια συζευγμένα με νανοσωματίδια χρυσού και επιτρέπει την ταυτοποίηση των αλληλομεταθέσεων δια γυμνού οφθαλμού, έπειτα από πολλαπλασιασμό με RT-PCR. Σε αντίθεση με τις μέχρι τώρα χρησιμοποιούμενες μεθόδους ανίχνευσης αλληλομεταθέσεων, η ανάλυση με το βιοαισθητήρα είναι απλή, δεν απαιτεί ειδικά όργανα και αποφεύγει πολλά στάδια επωάσεων και εκπλύσεων. Αντικείμενο του Κεφαλαίου 6 της διατριβής είναι η ανάπτυξη μεθόδου υβριδοποίησης DNA για την ταχεία ανίχνευση βακτηριακής επιμόλυνσης σε αρθροπλαστικές επεμβάσεις, ένα σημαντικό πρόβλημα στην ορθοπεδική. Απομονώνεται DNA από δείγματα αρθρικού υγρού, ακολουθεί πολλαπλασιασμός με PCR χρησιμοποιώντας καθολικούς εκκινητές και ανίχνευση των προϊόντων με βιοαισθητήρα DNA. Ανιχνεύονται οι μικροοργανισμοί Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Haemophilus influenza, Enterococcus faesium και Streptococcus pneumoniae. Στο Κεφάλαιο 7 περιγράφεται η εφαρμογή του βιοαισθητήρα DNA για την ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών (GMO) σε τρόφιμα. Αν και η παρουσία GMO μπορεί να διαπιστωθεί με ανίχνευση είτε της νέας πρωτεΐνης που συνθέτει το διαγονιδιακό φυτό ή της αλληλουχίας DNA που έχει εισαχθεί σ’ αυτό, το DNA είναι ο προτιμότερος αναλύτης λόγω της μεγαλύτερης σταθερότητάς του, ιδιαίτερα σε επεξεργασμένα τρόφιμα. Χαρακτηριστικές αλληλουχίες DNA που περιέχονται στα περισσότερα GMO, δηλαδή ο προαγωγέας 35S και ο τερματιστής NOS, πολλαπλασιάζονται με PCR και τα προϊόντα ανιχνεύονται με δοκιμασία υβριδοποίησης στο βιοαισθητήρα DNA. Η παρούσα εργασία εισάγει, για πρώτη φορά στο πεδίο της ανάλυσης GMO, έναν βιοαισθητήρα DNA τύπου εμβαπτιζόμενης ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων.