Γονιδιακή κλωνοποίηση μορίου κυτταρικής συνάφειας του νευρικού συστήματος

Η μοριακή κλωνοποίηση, ο χαρακτηρισμός και, η διαλεύκανση της βιολογικής λειτουργίας των μορίων κυτταρικής συνάφειας στο νευρικό σύστημα σπονδυλωτών και, μη, θα οδηγήσει, στην κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που περιλαμβάνονται σε σημαντικά βήματα της ανάπτυξης του νευρικού συστήματος (κυτταρική μετανάστευση, διαφοροποίηση, κυτταρική συσσώρευση, ανάπτυξη και δεσμοποίηση νευραξόνων, συνάψεις). Σε αυτή την εργασία κλωνοποιήθηκε το μόριο κυτταρικής συνάφειας LN-10 στην όρνιθα με ετερόλογο cDNA ανιχνευτή (αρουραίου). Το μόριο LN-10 εκφράζεται ειδικά στο νευρικό σύστημα όρνιθας (παραγκεφαλίδα, οπτικό λοβό, ημισφαίρια) και απουσιάζει από μη νευρικούς ιστούς (συκώτι, αίμα, έντερο). Η έκφραση του μορίου LN-10 αυξάνει σταδιακά στην παραγκεφαλίδα μέχρι την 2 ημέρα μετά την γέννηση από την 14 εμβρυϊκή ημέρα και ακολούθως ελαττώνεται σημαντικά. Το μόριο LN-10 εκφράζεται σε κοκκώδη κύτταρα της εξωτερικής και εσωτερικής κοκκώδους στοιβάδας παρεγκεφαλίδας και οπτικού λοβού. Σύγκριση του LN-10 με άλλα μόρια δείχνει ομολογία με πρόδρομα μόρια Ελαστίνης, με την N-Cadherin στην όρνιθα και την Notch πρωτεΐνη στην Δροσόφιλα. Η μελέτη του μορίου LN-10 έγινε με τεχνικές: Σύνθεσης και διαλογής cDNA βιβλιοθήκης, Southern, Northern και Western blot, in situ RNA-RNA υβριδοποίησης και προσδιορισμού της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Τα αποτελέσματα των παραπάνω μελετών έχουν ως εξής: 1. Με πειράματα Western blot ανιχνεύονται σε παραγκεφαλιδα όρνιθας πρωτεϊνικά μόρια με αντίσωμα anti-NILE, τα οποία διαφέρουν από τα μόρια που αναγνωρίζει αντίσωμα anti-NgCAM, στον ίδιο ιστό. 2. 0 σχετικός με την γλυκοπρωτεΐνη NILE, cDNA κλώνος Ρ12-13 από κύτταρα PC12 εμφανίζει ομολογία με κλάσματα DNA γονιδιώματος όρνιθας. 3. Ανιχνεύθηκαν τρεις cDNA κλώνοι από cDNA βιβλιοθήκη λgt11 παραγκεφαλίδας όρνιθας ηλικίας 2 ημερών με την χρήση του Ρ12-13 σαν ανιχνευτή (LN-9 0.5kb, LN-11 1.8kb, LN-10 2.0kb). 4. 0 κλώνος LN-10 προέρχεται πιθανόν από ένα γονίδιο και διακόπτεται στο επίπεδο του γονιδιώματος της όρνιθας από μία τουλάχιστον εμβόλιμη αλληλουχία. 5. Το μεγαλύτερο μήνυμα που αναγνωρίζει ο κλώνος LN-10 στον ιστό της παραγκεφαλίδας, είναι περίπου 2.0kb. 6. 0 κλώνος LN-10 απουσιάζει από μη νευρικούς ιστούς όρνιθας ενώ αναγνωρίζει στον οπτικό λοβό και στα ημισφαίρια μηνύματα RNA (2.0, 4.2, 5.2 και 6.8kb), τα οποία πιθανό να προέρχονται από διαφορική ωρίμανση του mRNA ενός γονίδιου. 0 κλώνος LN-10 εμφανίζεται στην παραγκεφαλίδα όρνιθας από την Ε14 εμβρυϊκή ημέρα, αυξάνεται η παρουσία του τις ημέρες γύρω από την γέννηση και σχεδόν εξαφανίζεται σε ώριμη όρνιθα Ρ17. 8. Προσδιορίσθηκε η νουκλεοτιδική αλληλουχία του κλώνου LN-10 (1941 νουκλεοτίδια), η οποία περιλαμβάνει ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 1620 νουκλεοτιδίων και μπορεί να συνθέτει πολυπεπτιδ ική αλυσίδα 543 αμινοξέων. Σύγκριση με γνωστά μόρια και ιδιαίτερα με μόρια CAM έδειξε ομολογία με πρόδρομα μόρια Ελαστίνης με την N-Cadherin στην όρνιθα και Notch στην Δροσόφιλα. Απομονώθηκαν γονιδιακοί κλώνοι σχετικοί με τον LN-10 από βιβλιοθήκη γονιδιώματος όρνιθας λΕΜΒL.