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L’infezione da Papillomavirus Umani (HPV) ad alto rischio oncogeno costituisce un importante fattore di rischio per l’insorgenza di lesioni displastiche a livello della cervice uterina e per la progressione in senso neoplastico di tali lesioni. Negli ultimi anni è emersa la necessità di valutare l’associazione fra carica virale e storia naturale delle lesioni cervicali HPV-correlate. A questo scopo abbiamo messo a punto un saggio di Real Time PCR, in formato Sybr Green, in grado di quantificare il DNA di HPV presente in campioni citologici cervicali e di fornire un risultato normalizzato per numero di cellule grazie alla quantificazione del gene housekeeping gliceraldeide-3-fosfato-deidrogenasi (GAPDH). Per l’identificazione di un ampio numero di HPV rilevabili in lesioni premaligne, abbiamo studiato un pool di primer di consenso che consente l’amplificazione di un frammento della regione L1 del DNA di 8 importanti genotipi mucosi ad alto rischio oncogeno (16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58) e dei 2 principali genotipi a basso rischio (6, 11). Il saggio consente non solo la quantificazione del DNA di HPV ma anche la genotipizzazione mediante analisi delle curve di melting. Il GAPDH viene amplificato in una reazione separata da una coppia di primer specifici. La quantificazione di un gene housekeeping permette di effettuare una valutazione del DNA di HPV che tenga conto della variabilità per numero di cellule dei campioni in esame. Per la validazione della tecnica sono stati utilizzati per per l’HPV plasmidi contenenti la regione L1 del DNA dei 10 genotipi studiati, per il GAPDH DNA genomico umano. Il saggio è stato quindi utilizzato per analizzare 30 campioni citologici cervicali provenienti da donne con lesioni di diverso grado (ASCUS, LSIL, HSIL). I risultati indicano come la Real-Time PCR da noi sviluppata sia una tecnica altamente sensibile e riproducibile e possa quindi essere utile nello studio della correlazione fra carica virale e rischio di progressione neoplastica.

SVILUPPO DI UN SAGGIO DI REAL-TIME PCR PER LA QUANTIFICAZIONE DEL DNA DI HPV IN CAMPIONI CITOLOGICI CERVICALI