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Con el fin de evaluar la utilizacion de secuencias del espaciador interno transcrito (ITS) en estudios de genetica de poblacion de cianobacterias marinas, se amplifico y clono la secuencia del gen ARNr 16S junto a la region espadadora 16S-23S ARNr de seis cepas de Prochlorococcus y Synechococcus. Se analizaron los amplicones del ITS por electroforesis en gel de gradiente de desnaturalizacion (DGGE) y por polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion terminal (T-RFLP). Al aplicar los metodos estandares de estas tecnicas, se obtuvo mas de una banda o fragmento de restriccion terminal (T-RF) por cepa o secuencia clonada. Informes en la literatura han sugerido que estas anomalias podrian ser atribuidas a la formacion de estructuras secundarias. Por consiguiente, la estructura secundaria de las secuencias de ITS de las cepas de Prochlorococcus y Synechococcus fue modelada a las diferentes temperaturas que se utilizaron durante la reaccion en cadena de polimerasa (PCR). Dicho modelamiento predijo la existencia de bucles que podrian persistir incluso durante la temperatura de extension. Es probable que estos bucles generen productos de PCR con fragmentos incompletos y hebras simples. En este trabajo se modifico el procedimiento del metodo de T-RFLP anadiendo el partidor marcado en los ultimos dos ciclos. Esto resulto, para la mayoria de los casos, la obtencion de un solo fragmento de restriccion por ribotipo. La aplicacion de esta tecnica a una muestra del medio ambiente obtenida frente al norte de Chile, demostro que es posible identificar la presencia, y determinar la abundancia relativa, de varios linajes filogeneticos de los generos Prochlorococcus y Synechococcus que habitan la zona eufotica. El analisis filogenetico de las secuencias de ITS obtenidos por clonacion y secuenciacion de ADN a partir de la misma muestra confirmo la presencia de los diferentes genotipos. Con la modificacion propuesta, el metodo de T-RFLP debiera ser adecuado para el estudio de la diversidad en poblaciones naturales de cianobacterias, pudiendo transformarse en una importante herramienta para estudiar los factores que influyen en la estructura genetica de estos organismos.

revista chilena de historia natural

Diversity of the marine picocyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus assessed by terminal restriction fragment length polymorphisms of 16S-23S rRNA internal transcribed spacer sequences