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Catalytic cleavage reactions by glucoamylase or phosphorylase b were monitored directly on an amylopectin-immobilized 27 MHz quartz-crystal microbalance (QCM). As a first example, we could follow kinetically the enzyme binding to the substrate (binding (kon) and dissociation rate constants (koff) and intramolecular hydrolysis rate constant (kcat) of glucan hydrolysis by glucoamylase by detecting directly the formation and decomposition of the enzyme-substrate (ES) complex as mass changes. Secondly, glucan phosphorolysis by phosphorylase b was directly observed by two methods through reactions on a QCM. All kinetic parameters for the enzyme binding to the substrate kon and koff, and dissociation constant, Kd, the AMP binding to the enzyme as activator (KAMP), and the catalytic rate constant (kcat) were obtained from curve fittings of time-courses of frequency (mass) changes. The obtained kinetic parameters were compared with those from Michaelis-Menten kinetics in the bulk solution. A. Introduction In general, most enzyme reactions have been devotedly investigated by using a Michaelis-Menten equation (steady-state kinetics). In this kinetics, the concentration of the enzyme-substrate (ES) complex was hypothesized to be nearly constant during the reaction, because of relative difficulty to detect the concentration of the ES complex (1,2). The reaction rate was simply obtained from the initial rate of the product increase by various methods such as colorimetric and stopped-flow fluorescent methods (3-7). If the formation and decomposition of the ES complex could be followed directly during the reaction, more accurate kinetic constants might be obtained. We report on the direct monitoring of enzymatic glycoside hydrolysis and phospholorysis on a Quartz-crystal Microbalance. B. What is a Quartz-Crystal Microbalance (QCM)? To investigate interactions between biomolecules, such 要 約 グルコアミラーゼもしくはホスホリラーゼbに よる触媒的 分解反応についてアミロペクチンを固定 した27MHz水 晶発振 子マイクロバランス(QCM)に よって直接モニタリングした。一 番目の例として、グ ルコアミラーゼによる加水分解反応におけ る基質への酵素の結合(結 合速度定数、解 離速度定数)お よび加 水分解速度定数を酵素基質複合体の生成および分解による直接 重量変化 として検出することにより、動 力学的に追跡できた。 二番 目の例 としてはホスホリラーゼbに よるグルカン加 リン酸 分解をQCM上 での反応を通 して、2つ の方法で直接観察 した。 酵素の基質に対する結合、活 性化剤の酵素への結合、お よび触 媒速度定数などの全ての動力学的パラメータを振動数(重 量)の 経時変化のカーブフィッティングにより求めた。得 られたパラ メータは溶液中で求められるミカエリスメンテン動力学の値と 比較検討 した。 A. 緒 言 一般にたいていの酵素反応はミカエリスメンテン式を用い てもっぱら研究されてきた。こ の動力学では酵素・基 質(ES)複 合体が反応の間、ほ とんど変わらず一定であると仮定 されてい る。な ぜならES複 合体の濃度を検出するのが比較的困難であ るからである(1、2)。反 応速度は熱容量測定法やス トップ ドフ ロー蛍光法などのような様々な方法によって、生 成物の初期増 加速度から単純に得られる(3-7)。も しES複 合体の生成および 分解を反応の間中、直 接追跡できたらより正確な動力学的値を 得ることが出来るであろう。 我々はこれまでに27MHzの 水晶発振子マイクロバランス (QCM)がDNA-DNA間 相互作用(8)、DNA-タ ンパク質間相互作 用、RNA-ペ プチ ド間相互作用、糖 脂質-タ ンパク質間相互作 用、お よびペプチ ド-ペプチ ド間相互作用、お よびDNA上 での 酵素反応のようなさまざまな分子認識を直接、定 量的に検出す (c) 2005 FCCA (Forum: Carbohydrates Coming of Age) 71 Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol. 17 No. 94 (March 2005) pp. 71-83 as nucleic acid hybridization, DNA transcription, and assembly of protein complexes, various spectroscopic techniques such as NMR, MS, FRET, and fluorescence polarization are employed. Furthermore, X-ray crystallography, gel shift assay, isothermal titration calorimeter, analytical ultracentrifugation, and ELIZA are also significantly useful tools for their study. However, some methods often require chemical modifications and it is difficult to perform quantitative analysis. As most techniques are hardly able to get information of momentary interactions, it is complicated to comprehend the mechanisms of their molecular recognitions. On the contrary, surface plasmon resonances and quartz-crystal microbalances can perform real-time monitoring of the interactions without chemical modifications to analytes. We have previously reported that a 27-MHz quartz-crystal microbalance (QCM) is a useful tool to directly and quantitatively detect various molecular recognitions such as DNA-DNA るのに有用なツールであることを報告してきた。27MHz QCM は水溶液中での重量変化に対 してとても高感度であ り、そ の共 鳴振動数はナノグラムレベルでQCM電 極上で増加 した重量と 比例して振動数が減少することが分かっている。QCMシ ステム は静的な結合過程のようなホス ト分子-ゲス ト分子間の分子認識 を検出するのに有用であった。我 々は動的な分子認識や酵素反 応のような反応ステップについても追跡できると考えている。 本報では、水 晶発振子マイクロバランス上での酵素的糖鎖 加水分解、加 リン酸分解反応の直接モニタリングについて述べ る。 B. 水晶発振子マイクロバランス(QCM)法 とは? 核酸のハイブリダイゼーションやDNAの 転写、タ ンパ ク 質複合体の形成(9)の ような生体分子間の相互作用を調べるた めには、NMR、 MS、 FRET、蛍 光偏光法のようなさまざまな分

Gravimetric Analyses of Enzymatic Glucan Hydrolysis and Phosphorolysis on a 27MHz Quartz-Crystal Microbalance