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In this work we used the factorial design of experiments for the preparation of chitosan particles loaded with the vegetable hormone 1,3-indoleacetic acid (AIA) to study its controlled release in water. The chitosan particles were prepared by dissolving the hormone and chitosan in acetic acid and then dripping in NaOH solution with constant stirring. Factorial Design 23 was used to study the concentration of chitosan (% chitosan), gelation time in NaOH (time in NaOH) and sodium tripolyphosphate (TPP) concentration (% of TPP). In response, the amount of hormone released in 2 hours, measured spectrophotometrically at 285 nm, was obtained. The results of the experimental design indicated that the three factors influence the released amount of AIA in 2 hours, where a higher concentration of chitosan increases the rate of release, while the higher concentration of TPP and longer gelation time in NaOH decreases the release rate. Key word: Factorial design, controlled release, 1,3 indoleacetic acid, chitosan. a Facultad de Ingeniería Industrial, Instituto de Investigación, Universidad de Lima. Av. Javier Prado Este 4600, Urbanización Fundo Monterrico Chico, Santiago de Surco, Lima, Perú, avalderr@ulima.edu.pe. b Facultad de Ciencias, Escuela Profesional de Química, Universidad Nacional de Ingeniería Av. Túpac Amaru 210, Lima 25, Perú. Uso del diseño factorial en los ensayos de liberación controlada del ácido 1,3 indolacético... 355 Rev Soc Quím Perú. 83(3) 2017 INTRODUCCIÓN Las hormonas vegetales (fitohormonas) son un grupo de sustancias orgánicas de origen natural, que influyen en los procesos de crecimiento, diferenciación y desarrollo de un vegetal, estas son: auxinas, giberelina, citoquininas, ácido abcísico y etileno1. La administración exógena de estas hormonas ganó relevancia a partir de los años 90; sin embargo, su uso fue limitado debido a que sus efectos biológicos tienen una estrecha región de concentración efectiva. En los últimos años, sistemas de liberación controlada de agroquímicos, en general, han recibido una gran atención. Esta tecnología tiene la ventaja de proteger de la degradación la sustancia a liberar, además de dosificar en forma adecuada a la planta, logrando mayor eficiencia en el uso de estas hormonas y por tanto un ahorro económico2. Entre los sistemas de liberación controlada resaltan las matrices biopoliméricas de quitosano, un polisacárido cuyas propiedades de biocompatibilidad, biodegradabilidad, no tóxico, y mucoadhesivo hizo que tenga un gran progreso para aplicaciones en medicina y farmacia3. En las aplicaciones para agricultura, gran parte de la literatura se refiere al quitosano, el cual, en 1978, se propuso como membrana protectora para la liberación controlada de agroquímicos. Posteriormente, se utilizaron películas y perlas fabricadas con hidrogeles de quitosano y sus derivados para la liberación controlada de urea y atrazina, un herbicida de uso común para controlar la cizaña en el maíz. Las matrices usadas sirvieron para controlar la liberación de los agroquímicos estudiados y extender su tiempo de liberación hasta 180 veces mayores que cuando estos se aplicaban solos. En el 2001, el quitosano tuvo efectos beneficiosos en plantas florales y de cosechas. Hacia el 2007 se estudió la adsorción de paraquat con polímeros naturales, y al año siguiente la quitina y el quitosano mostraron algunas potencialidades para la agricultura en Latinoamérica4. En el 2011, el quitosano aparece registrado por la Agencia de Protección Ambiental Estadounidense (EPA) como bioplaguicida para cultivos de uvas y fresas. Al año siguiente, se aplicó la microencapsulación con alginato en alimentos5, y en el 2014 se probó el efecto del recubrimiento de quitosano y alginato en la liberación controlada de fertilizantes aplicados al suelo6. A pesar de estos logros, aún existe un gran desconocimiento de sus aplicaciones potenciales en el encapsulamiento de ingredientes activos para la agricultura7. En la actualidad se tienen ciertas referencias del estudio de quitosano8,9 como matrices para la liberación controlada de algunos agroquímicos mientras que en el Perú, aún no se ha reportado el uso del quitosano/ alginato en la liberación controlada de hormonas vegetales. Actualmente, varios trabajos que estudian el efecto de algunas variables que influyen en la liberación controlada, son desventajosos, debido a que utilizan muchos experimentos, no evalúan cuantitativamente el efecto que tienen estas variables y si hay algún efecto de interacción10. El Diseño Factorial de Experimentos es una herramienta estadística que nos ofrece una metodología de la experimentación; asimismo, del procedimiento para la interpretación de los resultados obtenidos, realizando menor cantidad de experimentos con la mayor fiabilidad de sus resultados. Algunos trabajos realizados en este sentido han sido Ana Valderrama Negrón, Christian Jacinto Hernández, Susana Ponce García, Luis Manrique Pollera 356 Rev Soc Quím Perú. 83(3) 2017 reportados por Kincl11 y Iurian12. Con el diseño factorial se puede hacer los estudios de los efectos de cada uno de las variables (efectos principales) y de conexión entre ellas (efectos de interacción), esta última importante debido a que muchas variables actúan en modo de interacción e influyen en la liberación controlada. En el presente trabajo se han preparado micropartículas de quitosano cargadas con el ácido 1,3-indolacético utilizándose el diseño factorial 23 a dos niveles para evaluar el efecto de la concentración del quitosano (biopolímero), concentración del NaOH (como agente gelificante) y tripolifosfato de sodio (como agente entrecruzante) en la velocidad de liberación en agua. PARTE EXPERIMENTAL Reactivos El quitosano de mediano peso molecular tenía 1197 kDa medido viscosimétricamente y 87 % de grado de desacetilación medido por titulación potenciométrica con NaOH. El ácido 1,3 indolacético (AIA) y Tripolifosfato de sodio (TPP) fueron adquiridos de SIGMA. Hidróxido de sodio y ácido acético de grado analítico de FERMONT. Equipos Los espectros UV fueron medidos en un espectrofotómetro modelo UV1800, SHIMADZU CORPORATION. Procedimiento experimental a. Curva de calibración: Se disolvieron 8,8 mg de hormona AIA en 50 mL de agua, luego se tomó 1 alícuota de 1 mL y se llevó a 25 mL con agua y se hizo un barrido espectral entre 190 y 400 nm. Una vez determinada la longitud de onda de trabajo, se tomaron ciertos volúmenes para generar la curva de calibración de ALTA concentración: 2.5, 2, 1.5, 1 y 0.5 mL llevados a un volumen 25mL con agua. Para generar la curva de calibración de BAJA concentración se tomaron los volúmenes: 0, 125, 250, 375, 500 y 625 μL llevando a un volumen final de 25mL con agua. b. Ensayo de estabilidad de la hormona en medio acuoso: Se disolvieron 8,8 mg de hormona AIA en 50 mL de agua, luego se tomó 1 alícuota de 1 mL y se llevó a 25 mL con agua y se hizo un barrido espectral entre 190 y 400 nm durante un periodo de cuatro días. El experimento se llevó a cabo en duplicado, donde una solución fue expuesta a la luz y otra se mantuvo en la oscuridad. c. Preparación de las partículas a partir del quitosano disuelto con la hormona Se disolvió 1 g de quitosano en 50 mL ácido acético al 2% adicionando 0,05 g de hormona AIA en agitación hasta su completa disolución. Luego se dejó gotear sobre una solución de NaOH 2M en agitación constante a 1 y 3 horas de reposo. Las partículas se lavaron con agua abundante hasta obtener un pH neutro y finalmente se reticularon con tripolifosfato de sodio Uso del diseño factorial en los ensayos de liberación controlada del ácido 1,3 indolacético... 357 Rev Soc Quím Perú. 83(3) 2017 (TPP, pH=6,8) al 1 % y al 3 % por 24 horas. Se filtraron, lavaron y secaron al vacío en un desecador. Todo este proceso se llevó a cabo con los materiales cubiertos con papel aluminio para evitar el contacto con la luz. d. Experimento de liberación de la hormona El estudio de la liberación controlada se llevó a cabo en agua. A 25 mL de agua se agregaron 60 mg de las partículas cargadas con AIA y se agitó a 130 rpm en agitador magnético a temperatura ambiente. A distintos tiempos, se tomó 1 mL de la solución acuosa y se reemplazó con 1 mL de agua. Se obtuvo el espectro UV y se midió la absorbancia a 280 nm. e. Diseño experimental Se realizó un diseño factorial 23 para evaluar el efecto de tres factores que influyen en la preparación de las partículas cargadas: concentración del quitosano (% de quitosano), tiempo de gelación en hidróxido de sodio (tiempo) y porcentaje de tripolifosfato de sodio (% TPP). La preparación de las partículas cargadas se realizó según el procedimiento general del apartado c, los niveles de cada uno de los factores se encuentran en la tabla 1: Para el diseño factorial 23 se prepararon ocho matrices de partículas cargadas para realizar ocho experimentos de liberación a los niveles indicados en la tabla 1, y se codificaron según se muestra en la tabla 2. A partir de cada una de estas matrices se realizaron las pruebas de liberación controlada de la AIA (tal como se indica en párrafo d) en diferentes intervalos de tiempo. La cantidad liberada en un lapso de 120 minutos se tomó como respuesta para el estudio del diseño factorial 23. Tabla 1. Valores de los factores estudiados a Nivel (-) y Nivel (+) una solución de NaOH 2M en agitación constante a 1 y 3 horas de reposo. Las partículas se lavaron con agua abundante hasta obtener un pH neutro y finalmente se reticularon con tripolifosfato de sodio (TPP, pH=6,8) al 1% y al 3% por 24 horas. Se filtraron, lavaron y secaron al vacío en un desecador. Todo este proceso se llevó a cabo con los materiales cubiertos con papel aluminio para evitar el contacto con la luz. d. Experimento de liberación de la hormona El estudio de la liberación controlada se llevó a cabo en agua. A 25 mL de agua se agregaron 60 mg de las partículas cargadas con AIA y se agitó a 130 rpm en agitador magnético a temperatura ambiente. A distint

USO DEL DISEÑO FACTORIAL EN LOS ENSAYOS DE LIBERACIÓN CONTROLADA DEL ÁCIDO 1,3 INDOLACÉTICO CARGADO EN MATRICES DE QUITOSANO