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Las propiedades quimioterapéuticas e hipolipemiantes de los compuestos de origen vegetal han recibido gran atención con el objetivo de encontrar sustancias que puedan ser usadas como alternativas a las drogas convencionales. Los monoterpenos -presentes en aceites esenciales de frutas cítricas y plantas aromáticas- están siendo activamente muy estudiados debido a su bajo costo, buena biodisponibilidad y escasa toxicidad. Se demostró que muchos de ellos ejercen múltiples efectos sobre la vía del mevalonato (VM) en células de mamíferos que podrían causar los efectos terapéuticos deseados. La VM produce isoprenoides que son incorporados en diversos productos finales como colesterol, dolicol y ubiquinona o grupos prenilo utilizados por preniltransferasas para las modificaciones postraduccionales de ciertas proteínas de la superfamilia Ras y Rho, GTPasas pequeñas que regulan importantes procesos celulares, como proliferación celular, diferenciación, apoptosis y organización del citoesqueleto. Mutaciones en los genes que codifican estas proteínas forman oncogenes encontrados en una amplia variedad de tumores; por ejemplo, en un 90% de las neoplasias de páncreas, 50% de las tumoraciones de colon y tiroides y, aproximadamente, en un 30% de las leucemias mieloides y en el cáncer de pulmón. La etapa limitante de la velocidad de la VM es catalizada por la 3-hidroxi-3-metil glutaril coenzima A reductasa (HMGCR), enzima que se encuentra regulada -a nivel transcripcional, traduccional y postraduccional- a través del propio colesterol y de algunos intermediarios de la vía. La VM está presente en células de todos los tejidos estudiados y es particularmente activa en el hígado, órgano que cumple un rol central en el mantenimiento de la homeostasis del colesterol corporal. La familia de las estatinas está constituida por drogas naturales (de origen fúngico), semisintéticas (obtenidas por modificaciones de las anteriores) y sintéticas. Estos compuestos son estructuralmente similares a la mevalonolactona, característica que les posibilita actuar como inhibidores competitivos de la HMGCR. Uno de los posibles efectos de las estatinas es la modulación del crecimiento celular. Las estatinas se utilizan con éxito en el tratamiento de la hipercolesterolemia, ya que ocasionan una disminución del contenido de colesterol celular que se traduce, vía SREBPs, en un incremento del número de receptores para LDL con el concomitante aumento de la captación de LDL-colesterol del plasma. La dosis recomendada en terapias hipocolesterolemiantes en humanos es menor a 1mg/Kg/día. Pero, aún a dosis terapéuticas, las estatinas causan en ocasiones disfunción hepática, progresión de las cataratas, disfunción eréctil, miopatías, sensibilidad al tacto o debilidad con niveles elevados de creatina quinasa. Hipótesis de Trabajo - Debido a sus múltiples efectos sobre la vía del mevalonato, los monoterpenos tendrían “in vivo” efectos hipocolesterolemiantes y antitumorales - El hecho de que la inhibición de la HMGCR por los monoterpenos se produzca a través de un mecanismo diferente del empleado por las estatinas y que además afecten a la vía del mevalonato a otros niveles, sugiere la posibilidad de que el uso combinado de estatinas con monoterpenos naturales permita disminuir la dosis efectiva de estatinas en el tratamiento de hipercolesterolemias e incrementar la eficacia de ambos compuestos. Objetivos - Evaluar in vivo la actividad hipocolesterolemiante e hipolipemiante del geraniol (G) y avanzar en el conocimiento de los mecanismos de acción de este monoterpeno en el metabolismo del colesterol y los triglicéridos mediante el estudio de la expresión de genes claves como el de HMGCR, el receptor de LDL y de SREBP. De este modo, se avanzará en el conocimiento de los beneficios que aporta G en la prevención / tratamiento de enfermedades cardiovasculares. - Estudiar el efecto antitumoral de G y de las estatinas in vivo, utilizando un modelo de adenocarcinoma de pulmón humano, en células A549 implantadas en ratones atímicos, con el fin de aportar conocimientos sobre los mecanismos por los cuales podrían ejercer actividad antitumoral, como así también determinar la relación existente entre la VM y el control del crecimiento celular. - Estudiar el efecto y mecanismo de acción de la combinación de estatinas (simvastatina) con monoterpenos (G) sobre el metabolismo lipídico, la síntesis de colesterol y el crecimiento tumoral. Metodología Ensayos con Geraniol: Para los estudios in vivo se utilizaron ratones NIH nu/nu. Los animales de aproximadamente 6 semanas de edad, provistos por el Centro Atómico Ezeiza, fueron criados en nuestro bioterio en ambiente climatizado, con ciclos de luz (6 a.m. a 6 p.m.) y oscuridad (6 p.m. a 6 a.m.) controlados en forma automática. Estos fueron alimentados “ad libitum” con una dieta standard de laboratorio para roedores esterilizada con radiación gamma, permitiéndoseles libre acceso al consumo de agua esterilizada en autoclave. Los ratones se dividieron en dos grupos: animales no portadores y animales portadores de tumor, los cuales fueron implantados subcutáneamente con la línea tumoral A549. Cada grupo fue subdividido en lotes experimentales que recibieron una dieta suplementada con cantidades crecientes de geraniol (0; 25; 50; 75 mmol de geraniol/Kg dieta) durante 21 días. Durante el tratamiento el tumor fue medido dos veces por semana. Se cuantificó trigliceridemia y colesterolemia utilizando un kit enzimático, síntesis lipídica en hígado por incorporación de [14C]acetato y contenido hepático de colesterol (libre y esterificado) y de ácidos grasos por métodos bioquímicos. Se determinó HMGCR por western blot y se midió su actividad enzimática en microsomas de hígado aislados. Se establecieron los niveles de ARNm de HMGCR, del receptor de LDL y del factor de transcripción SREBP-2 por RT-PCR a partir de ARN hepático aislado. Se determinaron los niveles de apoptosis tumoral por el método de TUNEL y midiendo la actividad de caspasa-3 y se cuantificó Ras en homogenado y en membrana del tumor. Ensayos con Simvastatina: Se utilizaron ratones NIH hembras portadoras del genotipo nu/nu. Los animales de aproximadamente 6 semanas de edad, provistos por el Centro Atómico Ezeiza, fueron criados en nuestro bioterio como se detalla anteriormente. Luego de ser implantados subcutáneamente con la línea tumoral A549 se dividieron en dos grupos, control y experimental, al que se le suplementó la dieta con Simvastatina (0.5mM) en el agua de bebida. El tratamiento se prolongó por 3 semanas. Dos veces por semana se midió el crecimiento relativo del tumor, en los diferentes lotes de animales, utilizando un calibre. Luego de finalizado el tratamiento los ratones fueron sacrificados y se obtuvieron los tumores y los hígados de los mismos. Se determinó el porcentaje de células apoptóticas en los tumores obtenidos al momento del sacrificio de los animales y se cuantificó la proteína Ras en homogenado y en membrana plasmática del tumor. Aquí también se determinó síntesis lipídica hepática y contenido de colesterol (libre y esterificado) y de ácidos grasos en hígado. Ensayos con Geraniol y Simvastatina: animales portadores de tumor subcutáneo de células A549, se separaron en cuatro grupos: un grupo control y tres grupos experimentales; un grupo tratado con G (50 mmol / Kg de dieta) adicionado al alimento, otro con S (50 mg / Kg peso / día) suministrada en el agua de bebida y un grupo con la combinación de ambos compuestos a las concentraciones previamente mencionadas (G + S). El tratamiento se realizó durante tres semanas, en las cuales se monitoreó el crecimiento de los tumores y se controló asimismo el peso, el consumo de alimento y de agua de los animales. A las 3 semanas de tratamiento los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y se obtuvieron muestras de suero, hígado y tumor. Se midió apoptosis tumoral y los niveles de Ras total y Ras anclada a membrana plasmática de las células tumorales. Se determinó colesterol plasmático, hepático y tumoral, incorporación en hígado y en tumor de [14C]acetato en lípidos totales, lípidos insaponificables y ácidos grasos. Resultados y Conclusiones - Hemos demostrado que el geraniol tiene efectos hipolipemiantes y antitumorales “in vivo” en ratones nude con dosis que no presentan toxicidad. - Se avanzó en el conocimiento de los mecanismos de acción de este monoterpeno sobre la vía del mevalonato debido a que hemos demostrado: - Inhibición de la HMGCR a nivel postranscripcional, con una disminución de la cantidad y actividad de la enzima. Como consecuencia de ello disminuye la colesterogénesis en hígado y en tumor y aumenta la expresión del receptor de LDL hepático como mecanismo compensatorio al descenso del colesterol intracelular. - Inhibición de la cantidad de proteína Ras unida a membranas sin modificación de los niveles totales de la misma. Estos resultados sugieren una disminución de la prenilación por limitación en la disponibilidad de precursores o bien por inhibición directa de las preniltranferasas. - Se demostró una disminución de la síntesis de ácidos grasos que sugiere un posible mecanismo responsable del efecto hipolipemiante ejercido por el geraniol. - Se demostró un efecto proapoptótico y antiproliferativo del geraniol. A partir de nuestros resultados se sugiere que estos efectos se deberían a la limitación en la disponibilidad de lípidos esenciales para el crecimiento tumoral. - La administración combinada de geraniol y simvastatina inhibió significativamente el crecimiento e indujo la apostosis tumoral, y demostró tener un efecto sinérgico sobre la inhibición de la síntesis de lípidos tanto hepáticos como tumorales. Esto reforzaría la hipótesis de la acción inhibitoria del geraniol en distintos puntos de vías del metabolismo lipídico. Consideramos que la labor desarrollada en el presente trabajo colabora con una mejor comprensión de la acción de un componente muy frecuente en los aceites esenciales sobre una compleja vía metabólica, con el objetivo de mejorar el diseño de estrategias terapéuticas que incluyan el uso de compuestos naturales de manera individual o en combinación con drogas sintéticas para la lucha contra el cáncer y enfermedades asociadas a dislipemias.

Estudio del mecanismo de acción en la interacción entre estatinas y monoterpenos en animales inmunodeficientes portadores y no portadores de tumores de origen humano