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En este trabajo de tesis, se utilizó el virus de la psorosis de los cítricos (CPsV), un virus ssRNA de sentido negativo, sin envoltura, tripartito que codifica 4 proteínas: una replicasa (RdRp, 280kDa), una proteína pequeña de 24kDa (24K), una aspartil proteasa (54kDa) y una proteína de cubierta (48 kDa). En los últimos años, se ha profundizado en el conocimiento de las funciones y localizaciones sub-celulares de las proteínas de CPsV por parte de nuestro grupo. Se ha podido caracterizar a dos de sus proteínas (54KCPsV y 24KCPsV) como supresoras virales, aunque los mecanismos por los cuales llevan a cabo su función han sido poco explorados. En este trabajo de Tesis nos propusimos investigar aspectos concernientes a la biogénesis y acumulación de miARNs de C. sinensis y su relación con la infección viral. De esta forma, nos focalizamos en el estudio del mecanismo de procesamiento de precursores de miARNs de naranjo dulce y su alteración mediada por proteínas del virus de la psorosis de los cítricos. El trabajo de dividió en 4 capítulos: En el capítulo 1 nos propusimos caracterizar a nivel de secuencia y estructura 10 familias de pre-miARNs de C. sinensis: se analizaron las familias de precursores de 10 miARNs de C. sinensis, en relación a su secuencia y estructura. Se compararon los determinantes estructurales encontrados con las respectivas familias de A. thaliana y se propusieron mecanismos de procesamiento para cada uno de ellos. El capítulo 2, tuvo como objetivo estudiar la acumulación de pre-miARNs en muestras provenientes de plantas de C. sinensis infectadas con CPsV y su interacción con proteínas virales. Se demostró que la acumulación de 6 pre-miARNs conservados en C. sinensis aumentan su acumulación en plantas infectadas con CPsV respecto de las muestras sin infectar y que estos cambios están relacionados con la severidad de los síntomas. Estos resultados, a su vez, se correlacionan con la reducción de las especies maduras reportadas previamente (Reyes et al., 2016) y con el aumento de los transcriptos targets de estos miARNs que serán analizados en el Capítulo 3. Se observó una clara alteración en la biogénesis de miARNs mediante ensayos de RIP, lo que podría suponer una interacción de las proteínas virales de CPsV con alguna de las proteínas accesorias del procesamiento de miARNs durante la infección, limitando su función y por consiguiente afectando el procesamiento de dichos miARNs. Para el capítulo 3, tuvimos como objetivo estudiar la acumulación de transcriptos targets de miARNs y su relación con la sintomatología en plantas de C. sinensis infectadas con CPsV. Con nuestro trabajo, pudimos predecir bioinformáticamente 10 genes targets correspondientes a cuatro miARNs de C. sinensis que no habían sido validados en reportes previos. A su vez, analizamos su acumulación durante la infección y pudimos asociar aspectos relacionados a la sintomatología causada por la enfermedad. Finalmente, el capítulo 4 se centró en analizar la interacción entre la proteína 24KCPsV y proteínas de la maquinaria de procesamiento de miARNs. Los resultados obtenidos indican que la proteína viral co-localiza con las 3 proteínas de maquinaria evaluadas (DCL1, HYL1 y SE) y, a su vez, se ha podido corroborar la interacción de 24KCPsV con las proteínas HYL1At y SEAt por las dos metodologías utilizadas, CoIP y BiFC. Estos resultados confirman la interferencia de 24KCPsV con la vía de biogénesis de miARNs explicada por la interacción proteína-proteína o proteína-ARN.

Estudio de los mecanismos de procesamiento de microARNs en plantas de naranjo dulce infectadas con el virus de la Psorosis de los cítricos