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Cinchona officinalis (Rubiaceae), especie endemica del Valle de Loja, ubicado en la region sur del Ecuador, es un recurso forestal de importancia medicinal y ecologica, ademas la especie ha sido catalogada como planta nacional y es un icono de la region sur por su aporte a la farmacopea mundial. Esta especie, entre los siglos XVII-XIX sufrio una gran presion en sus poblaciones debido a la extraccion masiva de la corteza para la cura del paludismo. Aunque la actividad extractiva genero grandes ingresos a la Corona Espanola y a la region Sur del Ecuador, esta fue poco o nada sustentable ecologicamente, provocando la desaparicion de la especie en muchos sitios de la provincia, pues, en su momento, no se consideraron alternativas de recuperacion de las poblaciones naturales. Actualmente la extraccion y consumo de la corteza en la zona de origen es baja o nula, sin embargo esta zona enfrenta nuevas amenazas. La deforestacion a causa de proyectos de desarrollo en infraestructuras, la practica de actividades agricolas y de ganaderia, y los efectos del cambio climatico han ocasionado, en estos ultimos anos, la fragmentacion de los ecosistemas. La mayoria de los bosques del sur del Ecuador se han convertido en parches aislados (los bosques en los que se distribuye C. officinalis no son la excepcion) siendo esta la principal causa para que la especie se encuentre en estado de amenaza. Los individuos de la especie tienen una alta capacidad de rebrote y producen semillas durante todo el ano; sin embargo la capacidad germinativa y la tasa de sobrevivencia son bajas, ademas de estas dificultades la especie requiere de la asociacion con otras especies vegetales para su desarrollo, lo cual ha limitado su distribucion en pequenos parches aislados. Con esta problematica, la recuperacion natural de las poblaciones es una necesidad evidente. Varios trabajos y esfuerzos previos se han realizado a nivel local: i. Identificacion de la distribucion actual y potencial; ii. Determinacion de la fenologia y fructificacion iii. Programas de educacion ambiental, iv. Analisis moleculares para determinar la diversidad genetica. v. Ensayos de propagacion vegetativa; y otras acciones de tipo cultural. No obstante, el estado de conservacion y manejo de las poblaciones naturales no ha mejorado significativamente, siendo necesaria la aplicacion de estrategias integradas de conservacion in situ y ex situ, que permitan la recuperacion y permanencia de las poblaciones naturales a largo plazo. El presente trabajo tiene como fin dar alternativas para el cultivo de tejidos in vitro de Cinchona officinalis centrados en la propagacion masiva a partir de semillas, analisis de la fidelidad genetica y alternativas de conservacion de tejidos. Los objetivos especificos que se plantean son: i. Analizar el proceso de germinacion y proliferacion in vitro. ii. Evaluar la estabilidad genetica en explantes cultivados in vitro, mediante marcadores ISSR. iii. Establecer protocolos de conservacion in vitro mediante limitacion del crecimiento y criopreservacion de segmentos nodales y yemas. Los resultados mas significativos de esta investigacion fueron: i. El desarrollo de protocolos eficientes para mejorar los porcentajes de germinacion y la proliferacion de brotes en explantos cultivados in vitro. Para evaluar el efecto de los fenoles sobre la germinacion, se determino el contenido total de fenoles y el porcentaje de germinacion en semillas de C. officinalis comparados con una especie de control, C. pubescens. Para inducir a proliferacion, se utilizaron segmentos nodales de plantulas germinadas in vitro en medio Gamborg (1968) suplementado con diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas). Los resultados obtenidos sugieren que el contenido de compuestos fenolicos es alto en las semillas de C. officinalis en comparacion con las semillas de C. pubescens. Estos fenoles pueden eliminarse con peroxido de hidrogeno o con lavados de agua para estimular la germinacion. La formacion de nuevos brotes y callos en la mayoria de las combinaciones de reguladores de crecimiento se observo en un periodo de 45 dias. El mayor porcentaje de proliferacion de brotes, formacion de callos y presencia de brotes adventicios se obtuvo en medio Gamborg (B5) suplementado con 5.0 mg/l 6-bencil-aminopurina y 3.0 mg/l de acido indol-3-butirico. ii. La evaluacion de la fidelidad genetica de los explantes obtenidos con distintas combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal y diversos subcultivos. Se realizo el seguimiento a los explantes obtenidos de la fase anterior, determinando el indice de multiplicacion y analizando la fidelidad genetica de los tejidos obtenidos por las dos vias regenerativas: brotacion directa y regeneracion de brotes a partir de callos. Este analisis se realizo por amplificacion mediante PCR de las secuencias ubicadas entre microsatelites-ISSR (Inter simple sequence repeat). El medio Gamborg (B5) con 3.0 mg/l de AIB y 5.0 mg/l de BAP usado como medio de induccion en la primera etapa de cultivo genero el mayor indice de proliferacion (11.5). Un total de 13 marcadores ISSR fueron analizados, 6 de estos fueron polimorficos. El mayor porcentaje de variacion somaclonal fue inducido en presencia de 1.0 mg/l 2,4-D combinado con 0.2 mg/l Kin con un 1.8% en el segundo sub-cultivo de regeneracion, la cual incremento a 3.6% en el tercer sub-cultivo. Todas las combinaciones con presencia de 2,4-D produjeron la formacion de callos y presentaron variacion genetica. Por su parte la fidelidad genetica se mantuvo en los sistemas de propagacion directa a traves de la formacion de brotes a partir de meristemos preformados. iii. El establecimiento de protocolos de conservacion in vitro y crioconservacion de segmentos nodales y yemas. Para la conservacion limitando el crecimiento, se cultivaron segmentos nodales en los medios MS y B5 en tres concentraciones de sus componentes (25, 50 y 100%); y en medio B5 mas agentes osmoticos como el manitol, sorbitol y sacarosa en diferentes concentraciones (2, 4 y 8%); los cultivos se mantuvieron por 12 meses sin subcultivos. Para el establecimiento de protocolos para la crioconservacion (paralizacion del metabolismo) se usaron yemas axilares y apicales a las cuales se les aplicaron los metodos de encapsulacion-deshidratacion y vitrificacion. La efectividad de los protocolos usados se determino en funcion de la sobrevivencia, reduccion del crecimiento y regeneracion. Los resultados obtenidos en este apartado reflejan que un crecimiento limitado puede mantener tejidos durante 12 meses de almacenamiento, usando medio B5 mas manitol entre 2 y 8%. En los protocolos de crioconservacion, se obtuvo el mayor porcentaje de recuperacion tras la congelacion en NL en el tratamiento control seguido por el metodo crioprotector de encapsulacion-deshidratacion. Este trabajo brinda alternativas para la propagacion de C. officinalis bajo condiciones in vitro, partiendo de material vegetal con alta diversidad genetica. El material propagado puede ser fuente de germoplasma para la recuperacion y reforzamiento de las poblaciones naturales asi como una alternativa de produccion para las comunidades locales debido a la demanda actual de corteza de la zona de origen para la elaboracion de agua tonica.

Conservación de plantas regeneradas in vitro y análisis de la variación somaclonal de Cinchona officinalis, Linneo