English (United Kingdom)

https://curated-unify.zendy.io/wp-json/zendy-region/v1/featured_content/oa?rat=en

https://curated-unify.zendy.io/wp-json/zendy-region/v1/highlighted_journal/

Global: Zendy Plus annual

Presents the access of premium content as premium feature

Premium Content

Presents the keyphrase highlighting as premium feature

Keyphrase Highlighting

Presents the summarisation as premium feature

Summarisation

Insights

Presents the pdf analysis as premium feature

PDF Analysis

Presents the zaia usage as premium feature

ZAIA

Global: Zendy Tools annual

Global: Zendy Free Plan

Global: Zendy Tools monthly

Global: Zendy Plus monthly

Fully­human antibodies have a great therapeutic im­ portance; however, the development of stable strains providing a high level of production of full­size anti­ bodies is a challenging task, as antibody molecules contain two types of polypeptide chains. To develop the producing strain, random integration of the plas­ mid containing the gene encoding the target protein into the genome of the host cells is commonly used. The aim of this study was the development of an ori­ ginal expression system, using gene targeting to in­ tegrate the gene encoding the fully­human antibody into the transcriptionally active region of the genome of eukaryotic suspension cells CHO­S. To develop a stable strain, the cassette vector plasmid pCDNA5/FRT­ DHFR­CH­CL containing the site of homologous re­ combination and the genes encoding heavy and light chains of the fully human antibody of the IgG1/kappa class was constructed at the first step. Notably, DNA of the plasmid pCDNA5/FRT­DHFR­CH­CL was organized in such a way that the restriction sites for rapid cloning of DNA fragments encoding the variable domains of heavy and light chains were inserted upstream of the sequences encoding constant domains of the heavy and light chains of the antibody. Secondly, DNA frag­ ments encoding the variable domains of the heavy and light chains of antibody against orthopoxvirus protein p35 were inserted into the pCDNA5/FRT­DHFR­ CH­CL cassette plasmid. Then, CHO­S/FRT cells, which contain the FRT­site for homologous recombination and are able to produce green fluorescence protein GFP, were transfected with the constructed plasmid. After the insertion of the target genes into the FRT­site, GFP production was supposed to stop. Using this se­ lection system, a stable clone producing target anti­ body fh8E was selected with the level of production of about 100 μg/ml. The binding affinity of purified antibody fh8E with the targeted protein, measured Полноразмерные антитела человека обладают большим терапев­ тическим потенциалом, однако разработка стабильных штаммов, обеспечивающих высокий уровень продукции полноразмерных антител, является непростой задачей, поскольку молекулы антител содержат два типа полипептидных цепей. При получении штамма­ продуцента чаще всего используют подход, основанный на случай­ ной интеграции в геном плазмиды, содержащей ген, который ко­ ди рует целевой белок. Цель данного исследования – разработка оригинальной экспрессионной системы на основе направленной рекомбинации (генный таргетинг) для интеграции гена, кодиру­ ющего полноразмерное антитело человека, в транскрипционно активную область генома эукариотических суспензионных клеток CHO­S. Для создания высокопродуктивного стабильного штамма на первом этапе была сконструирована кассетная векторная плаз­ мида pCDNA5/FRT­DHFR­CH­CL, содержащая сайт гомологичной рекомбинации и гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи полно­ размерного антитела человека класса IgG1/kappa. ДНК плазмиды pCDNA5/FRT­DHFR­CH­CL организовали таким образом, что перед последовательностями, кодирующими константные домены тяже­ лых и легких цепей антитела человека, находились сайты узнава­ ния эндонуклеаз рестрикции для удобного встраивания фрагмен­ тов ДНК, кодирующих соответствующие вариабельные домены тяжелых и легких цепей. На втором этапе в кассетную плазмиду pCDNA5/FRT­DHFR­CH­CL были встроены ДНК­фрагменты, коди­ рующие вариабельные домены тяжелых и легких цепей антитела человека против ортопоксвирусного белка р35. Затем полученной плазмидой трансфицировали эукариотические клетки CHO­S/FRT, содержащие FRT­сайт гомологичной рекомбинации и экспресси­ рующие белок GFP. При встройке целевых генов, кодирующих тя­ желые и легкие цепи антитела в FRT­сайт, продукция GFP должна была прекратиться. При использовании такой системы отбора был получен стабильный клон, продуцирующий целевое антитело fh8E с уровнем продукции около 100 мкг/мл. Аффинность связы­ вания очищенного антитела fh8E с таргетным белком, измерен­ ная методом поверхностного плазмонного резонанса, составила 12 нM. Антитело fh8E продемонстрировало вируснейтрализующие свойства в реакции ингибирования бляшкообразования вируса осповакцины в экспериментах in vitro.

Development of a stable eukaryotic strain producing fully human monoclonal antibody on the basis of the human antibody against ectromelia virus