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Legionella pneumophila is a pathogenic bacteria associated to aquatic habitat of natural and artificial environments. Clinical cases of legionellosis have been reported in Brazil but there is a lack of information about the incidence and concentration of this bacterium in environmental sources. Thus, the present study was designed to evaluate the occurrence of legionellae in São Paulo city, Brazil, using different methods of detection and identification. Sixty-seven water and biofilm samples from natural reservoirs and man-made systems were collected and analyzed for the presence of Legionella spp by culturing onto a selective medium, coculture in axenic free-living amoebae and direct fluorescent antibody (DFA) assay. Results showed that freshwater of reservoirs did not contain legionellae, Legionella pneumophila was isolated from man-made systems, with predominance of Legionella pneumophila serogroup 1 strains. Although there was no statistical difference among the proposed detection methods, the plate culture method yielded a higher number of L. pneumophila positive samples, followed by amoebic coculture procedure and direct fluorescent antibody assay. Results of PCR and sequencing reactions revealed that application of macrophage infectivity potentiator gene as a molecular marker was an important tool for the identification of environmental isolates of L. pneumophila. The agreement among the three detection methods-when all methods yielded similar results- and the prevalence of a single Legionella species in the sampled man-made systems could suggest that the occurrence of this bacterium had been influenced by the higher concentration of metallic ions dissociated in water of those systems than in natural reservoirs. Thus, the results of this study revealed that the water of man-made systems in Sao Paulo may serve as a reservoir for L. pneumophila and other microorganism, including free-living protozoans. Legionella pneumophila é uma bactéria patogênica associada à habitats aquáticos de ambientes naturais e artificiais. Casos clínicos de legionelose têm sido descritos no Brasil, mas a incidência e concentração desta bactéria em fontes ambientais ainda são pouco conhecidas. Assim, o presente estudo foi desenvolvido para avaliar a ocorrência de bactérias do gênero Legionella na cidade de São Paulo, Brasil, utilizando diferentes métodos de isolamento e identificação. Sessenta e sete amostras de água e biofilme de reservatórios naturais e sistemas artificiais de climatização de ambientes interiores foram coletadas e analisadas quanto à presença de Legionella spp por métodos de cultivo em meio-de-cultura seletivo, cocultivo com amebas de vida livre axênicas e ensaios de imunofluorescência direta (IFD). Os resultados demonstraram que bactérias do gênero Legionella não foram detectadas em reservatórios naturais de água, Legionella pneumophila foi isolada de sistemas artificiais de climatização, com predominância de cepas de Legionella pneumophila sorogrupo 1. Apesar de não ter havido diferença estatística significante entre os métodos de detecção propostos, o método de cultivo em placa produziu o melhor resultado quanto ao número de amostras positivas para L. pneumophila, seguido do procedimento de cocultivo com amebas e ensaio de imunofluorescência direta. Os resultados das reações de PCR e sequenciamento revelaram que a aplicação do gene potencializador de infecção em macrófagos como marcador molecular foi um importante implemento na identificação de isolados ambientais de L. pneumophila. A concordância existente entre os três métodos de detecção - quando todos os métodos produziram resultados similares - e a prevalência de uma espécie de Legionella nos sistemas artificiais amostrados poderia sugerir que a ocorrência desta bactéria tenha sido influenciada pela maior concentração de íons metálicos dissociados na água daqueles sistemas do que nos reservatórios naturais. Assim, os resultados deste estudo revelaram que a água proveniente dos sistemas artificiais de climatização de ambientes interiores pode servir como reservatório de L. pneumophila e outros microrganismos, incluindo protozoários de vida livre

Detection of Legionella pneumophila in water and biofilm samples by culture and molecular methods from man-made systems in São Paulo - Brazil