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We have developed a non-isotopic technique based on methylation-specific PCR (MSP) of the FMR1 promoter for the identification of fragile X full mutations among men. DNA samples were first treated with sodium bisulfite to convert unmethylated, but not methylated, cytosines to uracil, followed by PCR amplification with oligonucleotide primers specific for methylated versus unmethylated DNA. We designed two primer pairs: one produced a 142-bp fragment from the bisulfite-treated methylated CpG island, while the other generated an 84-bp product from the treated non-methylated promoter. In normal males only the 84-bp fragment was seen, while the diagnosis of FRAXA was doubly indicated by the appearance of a 142-bp product together with absence or weak visualization of the 84-bp band. As an indispensable internal control for the efficiency of the sodium bisulfite treatment, we used a primer pair specific for the imprinted maternal methylated version of the CpG island of the SNRPN gene on human chromosome 15. Using the methylation-specific PCR we identified with 100% sensitivity and accuracy eight previously diagnosed FRAXA male patients mixed with 42 normal controls. Because of its simplicity and high efficiency, methylation-specific PCR may become the method of choice for the diagnosis of the fragile X syndrome in mentally retarded males. Nós desenvolvemos uma técnica não-isotópica baseada na PCR para a identificação de mutações completas da síndrome do X-frágil em homens. O método é baseado na PCR específica para metilação do promotor do gene FMR1. Amostras de DNA são tratadas com bissulfito de sódio para converter citosinas não-metiladas para uracilo, seguindo-se amplificação por PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos para DNA metilado versus não-metilado. Desenhamos dois iniciadores: um produz um fragmento de 142 pb da ilha CpG metilada tratada com bissulfito de sódio, enquanto o outro gera um produto de 84 pb do promotor tratado não-metilado. Em homens normais apenas o fragmento de 84 pb é visto, enquanto o diagnóstico da síndrome do X-frágil é indicado duplamente pela aparição do produto de 142 pb e pelo desaparecimento ou visualização muito fraca da banda de 84 pb. Como um controle interno indispensável para avaliação da eficiência do tratamento com bissulfito de sódio, nós usamos iniciadores específicos para a versão materna metilada da ilha CpG do gene SNRPN no cromossomo 15 humano. Com a PCR específica para metilação nós identificamos com sensibilidade e acerto de 100% oito pacientes previamente diagnosticados como tendo a síndrome do X-frágil misturados com 42 controles normais. Dada a sua simplicidade e alta eficiência, a PCR específica para metilação pode tornar-se o método de escolha para o diagnóstico da síndrome do X-frágil em homens com retardo mental

Diagnosis of the fragile X syndrome in males using methylation-specific PCR of the FMRI locus