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Citrus canker, caused by the bacterial pathogen Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), is a disease with significant economic consequences for the Brazilian and global citrus industry due to reductions in production and fruit quality. Our laboratory has initiated studies for the identification and functional analysis of protein-protein interactions involving Xac systems involved in pathogenicity (Alegria et. al., 2004). One objective has been to study functional and physiological interactions between proteins that make up the Xac Type III secretion system (T3SS). The focus of the present study is to unravel the biological significance in Xac pathogenicity of the following previously identified protein-protein interactions: HrpB2-HrcU; HpaA-HpaBHrcV; HrpD6-HrpB1-HrpW. With therefore cloned, expressed and purified the abovementioned recombinant proteins. Specific polyclonal serum were produced and interactions between the proteins were studied in vitro using a variety of methods, including Far-Western Blot, Pull Down, fluorescence and circular dichroism. To monitor the individual contribution of these proteins in disease development in planta, we produced mutant Xac strains in which the hrpB2, hrcU, hpaA, hpaB, hrpB1 and hrpG genes were disrupted. The nonpolar knockouts as well as the corresponding complementation strains were infiltrated into Citrus sensensis plants and the development of citrus canker symtoms and bacterial proliferation in planta was evaluated. We also evaluated the T3SS-dependent secretion of proteins HpaA and HrpB2 by these Xac mutant strains. Structure-function relationships of the HrpB2 protein were studied in more detail. We developed experiments to determine the region of the protein essential for its function. We produced a series of hrpB2 mutants which were used to complement the hrpB2 knockout strain and evaluated their abilities to reverse the symptoms of the disease in the plant. The results demonstrate that the last six amino acids HrpB2 are important for its function in the development of disease symptoms by Xac. Lista de Abreviações Aa Aminoácido B-CIP 5-bromo 4-cloro 3-indofosfato CD Dicroísmo Circular CFU Unidades formadoras de colônias HR Resposta de hipersensibilidade IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranocidio M Concentração molar NBT Cloreto nitro azul de tetrazólio ND Não detectado OD Densidade ótica ORF Open reading frame PCR Reação em cadeia da polimerase SDS Dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE Electroforese em gel de SDS-poliacrilamida T3SS Sistema de secreção do tipo III TBS Tampão Tris base salino TBS-TT Tampão Tris base salino, 0,1% Triton, 0,1% Tween 20 TCA Acido tricloroacético Tris Tris-(hidroximetil)aminometano WT Cepa selvagem Xac Xanthomonas axonopodis pv. citri 306 Xcc Xanthomonas campestris pv. campestris Xcv Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Xoo Xanthomonas oryzae pv. oryzae Lista de Tabelas Pagina Tabela 1 Espécies e variedades de citros suscetíveis ao cancro cítrico 7 Tabela 2 Putativos genes efetores de Xac, Xoo e Xcc 26 Tabela 3 Genes do T3SS escolhidos para estudo funcional dos mesmos na patogenicidade de Xac. 33 Tabela 4 Detalhes dos genes e/ou fragmentos do T3SS de Xac clonados em seus respectivos vetores de expressão em E. coli. 37 Tabela 5 Oligonucleotídeos utilizados para amplificar genes do T3SS de Xac, para serem utilizados em sistemas de expressão em E. coli 38 Tabela 6 Expressão das proteínas recombinantes do T3SS de Xac 40 Tabela 7 Protocolos de purificação das proteínas recombinantes do T3SS de Xac 42 Tabela 8 Oligonucleotídeos utilizados nas construções a serem clonadas no vetor pNPTS138 55 Tabela 9 Construções no vetor pNPTS138 para obter a deleção de genes específicos do T3SS de Xac. 58 Tabela 10 Oligonucleotídeos utilizados para gerar as construções de complementação no vetor pUFR047 60 Tabela 11 Construções de complementação para cepas mutantes de Xac 62 Tabela 12 Oligonucleotídeos utilizados para as mutações sítio dirigidas realizadas na construção de complementação pUFR047_hrpB2 63 Tabela 13 Cepas de complementação: Xac ∆“gene”+vetor_“gene” das cepas mutantes Xac Δ“gene” 64 Lista de Figuras Pagina Figura 1 Microscopia eletrônica de transmissão de Xac 2 Figura 2 Lesão de cancro cítrico em tecido infectado 3 Figura 3 Sintomas de cancro cítrico dos grupos: asiático (cancro A) e o grupo da América do Sul, (cancro B) 4 Figura 4 Microscopia eletrônica de varredura em infecções de Xac em folhas de Citrus paradisi 5 Figura 5 Ciclo do desenvolvimento da doença do cancro cítrico 6 Figura 6 Modelo “ziguezague” ilustrando as etapas de desenvolvimento do sistema imunológico da planta durante infecção 10 Figura 7 Esquema das interações entre fitopatogenos e plantas 15 Figura 8 Crio-microscopia eletrônica para visualizar a organização estrutural do “complexo da agulha” 17 Figura 9 Representação esquemática do flagelo bacteriano e o T3SSs em Yersinia, Escherichia coli e Pseudomonas syringae 19 Figura 10 Estrutura do locus gênico hrp em Xanthomonas axonopodis pv. citri 21 Figura 11 Comparações de sintomas de cancro cítrico na superfície das folhas de citros 27 Figura 12 Mapas e seqüências dos vetores de expressão da série pET 36 Figura 13 Mapa do vetor suicida pNPTS138 53 Figura 14 Esquema mostrando a construção para geração de mutantes não polares para as proteínas HpaA, HrpB2, HrcU, HrpD6, HrpB1 e HrpG em Xac 54 Figura 15 Mapas de vetores para complementação em cepas mutantes de Xac 59 Figura 16 Esquema mostrando a construção utilizada para complementação das mutações não polares para os genes: hrpB1, hrpB2, hrcU e hpaA, em Xac 60 Figura 17 Indução e purificação da proteína recombinante HrcU207-357 69 Figura 18 Seqüência primária do fragmento HrcU207-357 70 Figura 19 Indução e purificação da proteína recombinante HrcU207-357AAAH 72 Figura 20 Indução e purificação da proteína recombinante HrcU277-3576xHis 73 Figura 21 Western blot confirmando especificidade do soro policlonal anti-HrcU207-357AAAH 74 Figura 22 Espectro de fluorescência para a proteína HrcU207-357AAAH 75 Figura 23 Dicroísmo circular (CD) da proteína HrcU e fragmentos derivados. 76 Figura 24 Indução e purificação da proteína recombinante HrpB2 77 Figura 25 Western blot confirmando especificidade do soro policlonal anti-HrpB2 78 Figura 26 Dicroísmo circular (CD) da proteína HrpB2 78 Figura 27 Interação de HrpB2 com HrcU207-357AAAH e HrcU277-3576xHis 80 Figura 28 Seqüência primaria da proteína HrpB2 de Xac de 130 aminoácidos 81 Figura 29 Espectros de emissão de fluorescência para HrcU207-264, HrcU207-357AAAH e HrcU277-3576xHis na ausência e na presença de HrpB2 82 Figura 30 Ensaio de “Pull down” demostrando a interação da proteína HrpB2 com HrcU277-3576xHis imobilizada numa resina de Ni. 84 Figura 31 PCR de colônia para Xac WT (cepa selvagem), Xac ∆hrcU e Xac ∆hrpB2 85 Figura 32 HrcU e HrpB2 contribuem na patogenicidade de Xanthomonas axonopodis pv. citri 86 Figura 33 Seqüências nucleotídica e protéica do gene hrpB2 88 Figura 34 Teste de patogenicidade de diversas cepas de complementação para o gene hrpB2 em plantas hospedeiras de laranja pêra 88 Figura 35 Representação do alinhamento de 37 seqüências protéicas da família de proteínas do Pfam de HrpB2 (PF09487) 90 Figura 36 Teste de patogenicidade de diversas cepas de complementação para o gene hrpB2 em plantas hospedeiras de laranja pêra 91 Figura 37 Unidades formadoras de colonia (CFU) de diversas cepas de Xac por cm de tecido de folha de laranja 92 Figura 38 HrpB2 é secretada via T3SS de Xac 94 Figura 39 Esquema da interação observada pelo sistema de duplo híbrido envolvendo as proteínas HpaA, HpaB e o domínio citosólico de HrcV 96 Figura 40 Indução e purificação das proteínas recombinantes HpaA6xHis, HpaB e HrcV323-645 97 Figura 41 Seqüência primaria da proteína HpaB 98 Figura 42 Tratamento da proteína HpaB à altas temperaturas 98 Figura 43 Espectro de massas obtido para a proteína HpaB pura 99 Figura 44 Dicroísmo circular da proteína HpaB 100 Figura 45 Espectro de massas obtido para a proteína HpaA6xHis pura 101 Figura 46 Cromatografia de exlusão molecular de purificação da proteína HrcV323-645 102 Figura 47 “Western blot” determinando a especificidade do soro policlonal obtido contra a proteína HpaB 103 Figura 48 “Far-Western blot” das proteínas HpaA6xHis-HpaB 105 Figura 49 “Pull down” das proteínas HpaA-HpaB 106 Figura 50 Interação entre as proteínas HpaB-HrcV323-645 por ensaio de “Far-Western blot” 107 Figura 51 “Far-Western Blot” para detectar a existência de um complexo ternário entre as proteínas HpaA6xHis-HpaB-HrcV323-645 108 Figura 52 Teste de patogenicidade para as proteínas HpaB e HpaA em plantas hospedeiras de laranja pêra 109 Figura 53 Monitoramento do crescimento da cepa ∆hpaB no hospedeiro e “in vitro” 110 Figura 54 HpaB é necessária para a secreção das proteínas HpaA e HrpB2 112 Figura 55 Indução e purificação da proteína recombinante HrpD66xHis 114 Figura 56 Indução e purificação da proteína recombinante HrpW 115 Figura 57 Purificação de HrpB1 analisadas por SDS-PAGE 18% e espectrometria de massa 116 Figura 58 Dicroísmo circular para as proteínas HrpB1, HrpD66xHis e HrpW 117 Figura 59 Espectros de N-HSQC para a proteína NHrpD66xHis 118 Figura 60 Seqüência primaria da proteína HrpD66xHis 118 Figura 61 “Western blot” confirmando especificidade do soro policlonal anti-HrpD66xHis 119 Figura 62 “Far-Western blot” das proteínas HrpB1-HrpD66xHis 120 Figura 63 “Far-Western blot” das proteínas HrpB1-HrpW 121 Figura 64 Ensaio de “Pull down” para determinar interação entre as proteínas HrpD66xHis-HrpB1 122 Figura 65 Dicroísmo circular para os complexos HrpW-HrpB1 e HrpD66xHis-HrpB1 123 Figura 66 Espectro de N-HSQC para a proteína HrpD66xHis marcada isotopicamente com N e para a interação entre NHrpD66xHis e HrpB1 125 Figura 67 Avaliação da patogênicidade de Xac ∆hrpB1 em plantas de laranja pêra 126 Figura 68 Avaliação da patogênicidade de Xac ∆hrpG em plantas de laranja pêra 127 Figura 69 Produção e purificação da proteína HrpE6

Identificação e análise funcional de interações proteína-proteína do sistema de secreção do tipo III do Xanthomonas axonopodis pv. citri