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MIRANDA, B. N. M. Clonagem, expressão e purificação de alfa receptores de folato de Homo sapiens para aplicações bioanalíticas em câncer. 2014. 76 f. Dissertação (Mestrado em Química Orgânica e Biológica) Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2014. In recent years the incidence of cancer has grown significantly globally. Even though, the techniques currently employed for the detection of cancer are not individually conclusive due to the subjectivity of the analysis, inherently invasive, and are unable to provide early diagnosis. Therefore, the development of new technologies for cancer detection and prognostic are justified. Cancer cells have specific receptors with high affinity towards folate and are highly replicative. Alpha folate receptors (FR) are extracellular proteins with specific biochemical properties since, with rare exceptions, are induced selectively in cancerous tissues and rarely expressed in normal cells, being highly sensitive and specific. In this work we produced FR heterologously and we immobilized it on a microsystem mimicking a cancer cell that will become an analytical standard for studies with biosensors. Firstly, we produced rFR in different E. coli strains, exploring variation of temperature and induction times, in which we observed the expression of insoluble protein. We also tried the expression in P. pastoris system, which was not efficient as well. Alternatively, we cloned FOLR1 gene in a special vector that enables the expression of FR fusioned with the Trigger factor from E. coli, a highly soluble molecular chaperone. Using SDS-PAGE, Western Blot, OFFGEL and mass espectrometry we observed the production of soluble TFFR. The recombinant protein was immobilized in liposomes, producing an analytical standard for studies with FR-based biosensors. Our findings open research possibility in drug development, like anti-folates, besides the development of new biosensors. Key-words: Cloning. Heterologous expression. Folate receptors. Biomarkers. Cancer. Lista de Ilustrações Figura 1 Estrutura química do ácido fólico. 4 Figura 2 Sequências nucleotídica e de aminoácidos e da Proteína FRα de Homo sapiens. Em amarelo esta destacada a sequência do peptídeo sinal. 6 Figura 3 Representação estrutural da proteína FR, extremidades N(azul) e C-terminal (vermelho). Coordenadas da proteína 4RLH do Protein Data Bank. 7 Figura 4 Esquema do processo de fracionamento de proteínas por OFFGEL (Agilent Tecnhologies). 10 Figura 5 Mapa do vetor de expressão pET28a clonado com o fragmento FOLR1 entre os sítios de restrição das endonucleases NdeI e XhoI. Esta construção possibilita a expressão da proteína FRα recombinante em fusão com 6×His-tag na porção N-terminal da proteína, após um sítio de trombina. 18 Figura 6 Representação esquemática da etapa de clonagem do FOLR1 no vetor modificado pRSETaTF. 21 Figura 7 Predição do mapa do vetor modificado pRSETaTF clonado com o fragmento FOLR1 entre os sítios de restrição das endonucleases BamHI e SacI. Essa construção codifica a expressão da proteína rFRα em fusão com a proteína Trigger Factor (E. coli) na porção N-terminal da proteína, além de uma 6×His-tag, com resistência à ampicilina. 22 Figura 8 Representação esquemática da metodologia de produção dos lipossomos. 33 Figura 9 Representações estruturais do lipídeo DGS-NTA(Ni):1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(ácidoN-(5-amino1carboxipentil)iminodiacético)succinil] (sal de níquel). 34 Figura 10 Expressão rFRα em BL21(DE3) a 30 o C por 5 h. a) Perfil eletroforético em gel de SDS-PAGE 15% e b) Membrana de nitrocelulose Western Blot detecção direta com pastilha SigmaFASTTM BCIP®/NBT B5655 (Sigma). Canaletas: M. Padrão de tamanho molecular (Fermentas); 1. Conteúdo proteico antes da indução (to); 2. Conteúdo proteico após a indução; 3. Fração solúvel do lisado celular; 4. Fração insolúvel do lisado celular, a 30 o C e 20 o C, respectivamente. As bandas indicadas com setas representam a rFRα, com 28,3 kDa. 35 Figura 11 Perfil eletroforético em gel SDS-PAGE 15%. Expressão rFRα em a) BL21(DE3)pTGROE a 30 o C por 5 h e em b) BL21(DE3)Rosetta a 30 o C por 5 h. Canaletas: M. Padrão de tamanho molecular (Fermentas); 1 e 2. Conteúdo proteico antes e após a indução, respectivamente; 3 e 4. Frações solúvel e insolúvel do lisado celular, respectivamente. 36 Figura 12 Perfil eletroforético em gel SDS-PAGE 15%. Teste de solubilidade da rFR expressa em BL21(DE3) a 30 o C por 5 h, com diferentes tampões de lise, I e II. Canaletas: M. Padrão de tamanho molecular (Fermentas); 1 e 2. Conteúdo proteico antes e após a indução, respectivamente; 3 e 5: Frações solúveis do lisado celular; 4 e 6. Frações insolúveis do lisado celular, com os tampões I (PBS 1×) e II (5% glicerol), respectivamente. As bandas indicadas com setas representam a rFRα, com 28,3 kDa. 37 Figura 13 Perfil eletroforético da reação de análise por restrição do clone pRSETaFOLR1 com a enzima EcoRI em gel de agarose 1%. Canaleta M: Padrão de DNA 1 kB GeneRuler (Thermo Scientific). 1: pRSETaTF-FOLR1 digerido com EcoR1. Em destaque a banda referente ao inserto de ~1200 pb. 39 Figura 14 Perfil eletroforético da PCR com o clone pRSETaTF-FOLR1 como DNA molde, em gel de agarose 1%. Canaleta M. Padrão de DNA 1 kB GeneRuler (Thermo Scientific); 1. Controle negativo; 2. PCR com pRSETaTF-FOLR1. Em destaque o segmento de DNA amplificado. 39 Figura 15 Alinhamento da sequência proveniente da análise por sequenciamento do clone pRSETaTF-FOLR1 com a sequência de DNA codificante da proteína FR. 40 Figura 16 Esquema representativo do novo tamanho esperado da proteína recombinante TFFR. 41 Figura 17 Análise da expressão da TFFRα em BL21(DE3) RIL a 37 o C por 5 h. a) Perfil eletroforético em gel SDS-PAGE 10%; b) Filme fotográfico obtido pela revelação do Western Blot, detecção secundária com Kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Scientific. Canaletas M. Padrão de tamanho molecular Spectra TM Multicolor Broad Range (Thermo Scientific); 1. Fração solúvel do lisado celular; 2. Eluição da coluna de Ni; PBS 1x + 250 mM Imidazol; 3. Expressão "padrão" da TF em outra fusão (controle positivo); 4. Eluição do controle positivo de TF. Em destaque a banda referente à TFFR na amostra purificada. 42 Figura 18 Análise de concentração e purificação da TFFRα. a) Perfil eletroforético em gel SDSPAGE 10%; b) Filme fotográfico obtido pela revelação do Western Blot, detecção secundária com Kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Scientific. Canaletas: M. Padrão de tamanho molecular Spectra TM Multicolor Broad Range (Thermo Scientific); 1. Fração eluida da coluna de concentração; 2. Fração concentrada pela coluna; 3. Fração eluida da coluna desalting; 4. Eluição do controle positivo de TF em fusão. Em destaque a banda referente à TFFR, podendo ser observadas bandas referentes à esta proteína truncada. 43 Figura 19 Análise de OFFGEL da amostra pré-purificada por cromatografia de afinidade. a) Perfil eletroforético em gel SDS-PAGE 12,5% das frações dos compartimentos 1-11 sobre fita IPG de pH 3-10. Detalhe comparando o perfil eletroforético em gel das frações 5 e 6 (b) com o filme fotográfico obtido pela revelação do Western Blot, detecção secundária com Kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Scientific (c). 44 Figura 20 Cromatograma do digerido triptico da banda referente à TFFR (~78 kDa) após prépurificação em coluna de Ni. As condições cromatográficas utilizadas foram descritas no ítem 1.11.4. 45 Figura 21 Resultado da digestão tríptica da proteína recombinante TF-FR, sendo mostrada apenas o resultado da digestão referente somente à porção do receptor. Em destaque os peptídeos encontrados (amarelo) e o início da proteína FR (seta azul). 46 Figura 22 Eletrólito suporte tampão fosfato 0,2 mol L -1 pH 7,2. Adição de 1 mL da solução de tetrahidrofolato em 80 mL do eletrólito suporte. Experimento conduzido em OCP (potencial de circuito aberto) sob agitação magnética constante. 49 Figura 23 Análise da diálise e ligação da TFFRα a lipossomos. a) Perfil eletroforético em gel SDS-PAGE 10%; b) Filme fotográfico obtido pela revelação do Western Blot, detecção secundária com Kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Scientific. Canaletas: M. Padrão de tamanho molecular Spectra TM Multicolor Broad Range (Thermo Scientific); 1. Amostra TFFR purificada e dialisada; 2. Sobrenadante dos lipossomos NTA; 3. Lipossomo sem Ni; 4. Lipossomo com Ni; 5. Amostra TFFR purificada em coluna de Ni. 50 Figura 24 Intensidade das bandas observadas nos poços 2, 3 e 4 do Western Blot da Figura 23. 51 Figura 25 Imagem de microscopia ótica digital dos GPI-proteolipossomos, de células HeLa. 52 Figura 26 Imagem de microscopia de força atômica (AFM) da amostra de GPI-proteolipossomos dispersa sobre mica e analisada no equipamento de AFM Nanosurf EasyScan 2, 50 × 50 μm. 53 Figura 27 Desenho esquemático do mecanismo de inserção do plasmídeo (contendo o DNA codificante da proteína de interesse) ao DNA genômico da levedura, através do crossover entre o loci e uma das regiões AOX1 do plasmídeo pPICZ previamente clonado. Eventos de multiplas inserções podem ocorrer. 57 Figura 28 Mapa do vetor pPICZA clonado com o fragmento FOLR1 entre os sítios de restrição das endonucleases EcoRI e NotI. Este inserto codifica a expressão da proteína FRα recombinante em fusão com uma cauda de histidina na porção N-terminal da proteína, além do fator- de secreção. As setas em destaque referem-se ao gene que codifica a resistência ao antibiótico zeocina e o gene FOLR1 inserido. 58 Figura 29 Eletroforese em gel de agarose. Confirmação da extração do DNA genômico. Canaletas: 1-8. Amostras do DNA genômico extraído de oito colônias distintas. 65 Figura 30 Eletroforese em gel de agarose 1%. Confirmação da clonagem do DNA genômico extraído através de PCR com primers 5'AOX1 e 3'AOX1. Canaletas: 1-8. Conteúdo da PCR das amostras do DNA genômico extra